HPLC法测定创伤愈合药喷雾剂中血竭素的含量

2012-11-14陈振振张灵英殷中琼

中国兽药杂志 2012年10期

陈振振，张灵英，李莉，殷中琼，张强，李开

(1.四川农业大学动物医学院，四川雅安 625014;2.四川农业大学生命理学院，四川雅安 625014)

血竭、乳香、没药等为中国传统医学中治疗皮肤疮疡和创伤的常用药，常单用或配伍用，其临床疗效已被肯定［1-2］，《本草纲目》记载这些药物具有收敛止血、活血化瘀、消肿止痛、解毒敛疮、祛腐与润肤生肌等作用。《大明本草》记载“治一切恶疮疥癣久不合者”，故血竭为最常用的生肌之药，诸家生肌方均不离此药［3-4］。乳香和没药常配伍使用，但乳香以活血散肿止痛为主，而没药以消肿止痛生肌为主［3］。现代药理研究表明油樟叶挥发油具有抗菌、镇痛和抗炎作用［5］。为了研制对皮肤创伤具有抗菌、抗炎、镇痛和收敛止血及祛腐与润肤生肌作用的外用药物，在实验室前期研究中将血竭素、乳香挥发油、没药挥发油、油樟叶挥发油几味具有上述功效的药物组成复方，制备成创伤愈合药喷雾剂［6］，临床上拟用于治疗动物的皮肤创伤、溃烂、感染等疾病。处方中血竭素的含量为其重要控制指标之一，据报道血竭素的含量测定方法有薄层扫描法［7］、高效液相色谱法［8-9］。为了控制该喷雾剂的质量，保证临床疗效，本试验采用HPLC法对制剂中的主要活性成分之一血竭素进行含量测定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器岛津 SH MADZU LC-2010C HT(CLASS-VP 6.13 multi)高效液相色谱仪(岛津国际贸易上海有限公司);JD100-3电子分析天平(沈阳龙腾电子称量仪器有限公司);双频数显台式清洗器(上海科导超声仪器有限公司);SZ-BⅢ型三重纯水蒸馏器(上海嘉鹏科技有限公司)。

1.1.2 药物与试剂血竭素高氯酸盐对照品(中国药品生物制品检定所，批号110811-200704);创伤愈合药喷雾剂(四川农业大学动物医学院药学系自制，批号 120308、120309、120310、120311、120312、120313);实验用甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯;水为三重蒸馏水。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件色谱柱为 Kromasil C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);乙腈 -0.05 mol/L 磷酸二氢钠溶液(50∶50)(用磷酸调pH为3.5)为流动相;检测波长440 nm，柱温40℃，流速1.0 mL/min，进样量为20 μL。理论板数按血竭素计算不得低于4000。

1.2.2 溶液的制备对照品溶液的制备：精密称取血竭素标准品(高氯酸盐血竭素)9.0 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加入3%磷酸甲醇溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀得浓度为0.1307 mg/mL(以血竭素计算)的对照品储备液。精密量取上述溶液2 mL，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得每毫升中含血竭素26.14 μg(血竭素重量=血竭素高氯酸盐重/1.377)。

供试品溶液的制备：精密量取创伤愈合药喷雾剂1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀后即得供试品溶液，贴标签放置备用。

阴性对照溶液的制备：取只含辅料的空白喷雾

剂作为阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

1.2.3 线性关系的考察精密吸取制备好的对照品(13.07、19.61、26.14、32.68、39.21、45.74 μg/mL)分别进样 20 μL，依法测定，记录峰面积(S，以血竭素峰计，以下相同)。以浓度(C，μg/mL)为横坐标，峰面积(S)为纵坐标，进行线性回归。

1.2.4 精密度试验精密量取同一血竭素对照品溶液20 μL(26.14 μg/mL)，在 1.2.1 项中的色谱条件下重复进样6次，记录血竭素峰面积，考察仪器精密度。

1.2.5 稳定性试验在1.2.1项中的色谱条件下，精密吸取对照品储备溶液 20 μL，于 0、2、4、8、16、24 h各进一次样，进行测定。

1.2.6 空白试验按处方比例和工艺，制成不含血竭素的空白创伤愈合药喷雾剂，精密量取1.0 mL空白溶液，置入10 mL容量瓶中，在1.2.1项中的色谱条件下进行测定，重复3次。

1.2.7 加样回收试验取已知含量的不同批样品(批号 120308、120309、120310、120311、120312 和120313，含血竭素分别为 0.0192、0.0188、0.0191、0.0188、0.0192、0.0190 mg/mL)6 份，精密量取 1.0 mL，分别置于6个10 mL棕色容量瓶中，分别加入精密量取的2×10-2mg/mL血竭素高氯酸盐甲醇溶液1.0 mL，用甲醇定容。将此6份溶液在1.2.1项中的色谱条件下测定，测定各峰面积后带入回归方程分析。

1.2.8 样品含量的测定精密吸取制备好的6份供试品溶液20 μL，分别进样，每份重复测定3次，取平均值为喷雾剂中血竭素的含量。

2 结果

2.1 方法的专属性研究分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各20 μL，在1.2.1项中的色谱条件下，供试品中血竭素色谱峰与对照品色谱峰保留时间一致，并与杂质峰分离度大于1.5，且阴性样品在相应的位置上无色谱峰干扰(图1～图3)。

2.2 线性关系的考察线性关系考察结果得回归方程为：Y=6 × 107X-1.5 × 105，r=0.9997(n=6)。结果表明血竭素浓度在 13.07 ～45.74 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.3 精密度试验精密吸取同一血竭素对照品溶液20 μL，在1.2.1项中的色谱条件下连续进样6次，血竭素平均峰面积值为 2276094，RSD为0.76%(n=6)。结果表明重复性良好，仪器精密度符合要求。

2.4 稳定性试验在1.2.1项中的色谱条件下，精密吸取对照品溶液，分别于 0、2、4、8、16、24 h 进样20 μL，测定峰面积，在24 h内血竭素的平均峰面积值为2275864，RSD 为0.48%(n=6)，表明试验稳定性良好。

2.5 加样回收试验取已知含量的不同批样品(批号 120308、120309、120310、120311、120312 和120313，含血竭素分别为 0.0192、0.0188、0.0191、0.0188 、0.0192、0.0190 mg/mL)6 份，精密量取1.0 mL，分别加入精密量取2×10-2mg/mL血竭素高氯酸盐甲醇溶液1.0 mL，按供试品溶液的制备方法操作，分别进样20 μL，测定其峰面积并计算加样回收率，平均回收率为98.29%，RSD为0.67%(n=6)(表1)。

2.6 样品含量测定取不同批次样品各2份，按供试品溶液制备方法制备，分别进样20 μL，每次重复测定3次，测得喷雾剂中血竭素的平均含量为0.01902 mg/mL(表2)

3 讨论

血竭素为色原酮类化合物，性质不稳定，见光易分解，在操作过程中应尽量避免强光直射，并用3%磷酸甲醇作为溶剂，使样品中的血竭素转变为血竭素的磷酸盐，增强其稳定性。HPLC法测定血竭素的含量应注意色谱柱条件，保证柱温。一般来说柱温升高会降低柱压，样品的保留时间会提前;柱温不恒定，对样品峰宽的影响比较明显。