CIK对人肺腺癌耐顺铂细胞A549/DDP杀伤效应及耐药逆转作用

李应林，李 宁，李 冉，田 昕

(遵义医学院附属医院 附属肿瘤医院，贵州 遵义 563099)

CIK对人肺腺癌耐顺铂细胞A549/DDP杀伤效应及耐药逆转作用

李应林，李 宁，李 冉，田 昕

(遵义医学院附属医院 附属肿瘤医院，贵州 遵义 563099)

目的探讨CIK细胞对人肺腺癌耐顺铂细胞A549/DDP体外杀伤效应及逆转作用。方法用MTT法分别检测顺铂、CIK细胞、CIK联合顺铂对人肺腺癌细胞A549及人肺腺癌耐顺铂细胞A549/DDP的杀伤活性，计算耐药倍数，逆转倍数。结果①顺铂对人肺腺癌细胞A549及A549/DDP的50%杀伤浓度(IC50)分别为1.823g/mL、6.392 g/mL，差异有统计学意义(P<0.05)，人肺腺癌细胞A549/DDP对顺铂的耐药倍数(IR)为3.506。②CIK对人肺腺癌细胞A549及A549/DDP均有杀伤作用，其IC50分别7.657×105个细胞/mL、7.955×105个细胞/mL，差异无统计学意义(P>0.05)。③不同浓度的CIK细胞(1×105,2×105and3×105个/mL)与人肺腺癌细胞共培养后，再加顺铂，其IC50值分别降至1.743g/mL、1.336g/mL、0.883g/mL，差异有统计学意义(P<0.05)；计算逆转倍数(FR)分别为(2.369、3.091、4.677)。结论①人肺腺癌细胞A549/DDP较A549对顺铂有明显的耐药性。②CIK对人肺腺癌细胞A549及A549/DDP均有杀伤作用，杀伤效果在两种细胞中无明显差异。③无毒剂量CIK联合顺铂作用于人肺腺癌细胞A549/DDP，可以增加顺铂对耐药细胞的杀伤活性。逆转倍数随着CIK密度的增加而增大，说明CIK细胞能部分逆转耐药细胞A549/DDP对顺铂的耐药性。

肺癌；细胞因子诱导的杀伤细胞；耐药；人肺腺癌耐顺铂细胞A549/DDP；肿瘤免疫治疗

细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells，CIK)治疗是近几年发展起来的肿瘤免疫治疗的全新策略，具有较高速度、较强杀瘤活性、对多种肿瘤细胞具有敏感杀伤活性、非MHC限制、并对正常骨髓造血影响轻微等优势【1】。目前国内外文献报道，CIK细胞能杀伤肿瘤细胞，还能逆转一些耐药细胞的耐药性，提高对化疗药物的敏感性。本研究拟在检测CIK细胞对人肺腺癌耐顺铂细胞A549/DDP的杀伤效应的同时计数耐药倍数和逆转倍数，初步探讨CIK细胞对人肺腺癌耐顺铂细胞A549/DDP逆转耐药作用。

1 材料与方法

1.1 CIK细胞的制备 取健康人外周血单个核细胞，经IFN-γ，IL-2，抗CD3单抗等联合诱导CIK细胞。

1.2 细胞培养 人肺腺癌细胞A549及人肺腺癌耐顺铂细胞A549/DDP用含10%胎牛血清的培养液，置37oC，5%CO2培养箱中培养。2～3 d换液。待细胞生长铺满80%培养瓶底时，胰酶传代，取指数生长期细胞进行实验。

1.3 实验分组 将人肺腺癌细胞A549及人肺腺癌耐顺铂细胞A549/DDP分为单纯细胞培养对照组、单独顺铂组、单独CIK组、CIK联合顺铂组。

1.4 MTT法分别检测顺铂的杀伤活性、CIK杀伤活性、CIK联合顺铂的杀伤活性。

1.4.1 MTT法检测顺铂对人肺腺癌细胞A549和肺癌耐顺铂细胞A549/DDP的杀伤作用 将人肺腺癌细胞A549及人肺腺癌耐顺铂细胞A549/DDP制成(2×104个细胞/mL)细胞悬液，以100 μl接种于96孔板中，加入100 μl不同浓度的顺铂，设调零组、对照组，每组设3个复孔，作用48h，加入MTT 20 μl，继续避光培养4h，吸出上清液，加入DMSO150 μl，震荡10 min，待结晶完全溶解，用酶标仪(570 nm波长)检测OD值。按公式计算细胞生长杀伤率(%)=1-(加药组OD值-调零组OD值)/(对照组OD值-调零组OD值)×100%。计算出顺铂50%杀伤浓度(IC50)及耐药倍数(RI)=耐药细胞IC50/敏感细胞IC50。

1.4.2 MTT法检测CIK对A549和A549/DDP的杀伤活性 方法及分组同上，将不同细胞密度CIK 100μl 加入。用酶标仪(570nm波长)检测OD值。计算CIK 50%杀伤密度(IC50)和10%杀伤密度(IC10)。

1.4.3 MTT法检测CIK联合顺铂对A549和A549/DDP的杀伤效应 方法和分组同上，选择不同细胞密度的无毒剂量的CIK细胞与不同浓度的顺铂联合使用，观察其对A549和A549/DDP的杀伤活性。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行统计学分析，结果采用单因素方差分析及t检验，P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 顺铂对A549和A549/DDP的杀伤效应及耐药倍数 MTT法分别检测顺铂对A549及耐顺铂细胞A549/DDP的杀伤作用，计算出顺铂对细胞A549的IC50=1.823g/mL；顺铂对耐顺铂细胞A549/DDP的IC50=6.392g/mL(P<0.05)。耐药倍数(IR)=3.506(见表1)。

表1 顺铂对A549和A549/DDP的杀伤效应

2.2 CIK对A549和A549/DDP的杀伤效应 MTT法分别检测CIK对A549及A549/DDP的杀伤效应，结果显示CIK对A549及A549/DDP均有杀伤，但差异没有统计学意义(P>0.05)，(见表2)。

2.3 CIK联合顺铂对A549/DDP的杀伤效应及逆转耐药作用 CIK(密度1×105个细胞/mL)联合顺铂：IC50=1.743g/mL；CIK(密度2×105个细胞/mL)联合顺铂：IC50=1.336g/mL；CIK(密度3×105个细胞/mL)联合顺铂：IC50=0.883g/mL，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。逆转倍数(FR)=IC50(不加逆转剂)/ IC50(加逆转剂)分别为2.369、3.091、4.677(见表3)。

表2 CIK对A549及A549/DDP的杀伤效应

表3 CIK(不同密度)联合顺铂对A549/DDP的杀伤效应

3 讨论

肺癌作为最常见的恶性肿瘤之一，发病率及死亡率位居全球恶性肿瘤首位。治疗手段包括手术、放疗及化疗为主的综合治疗，疗效不尽如人意，经过基础和临床研究，现以CIK治疗为代表的生物治疗已成为肿瘤治疗的重要手段。

CIK细胞是一种非MHC限制、新型、高效的免疫活性细胞，在临床得到了广泛的应用【2,3】，CIK细胞治疗已成为肿瘤的第四大治疗手段。

化疗目前仍是肺癌的主要治疗手段之一，其中顺铂是肺癌一线化疗主要药物，其耐药的产生是导致肺癌治疗失败的主要原因之一，研究其耐药机制及逆转耐药是临床亟待解决的问题。

本实验通过检测CIK细胞对人肺腺癌细胞A549及人肺腺癌耐顺铂细胞A549/DDP的杀伤效应，计算耐药倍数、逆转倍数对其逆转机制进行初步探讨。结果显示，A549/DDP所需顺铂剂量明显高于A549。证实A549/DDP较A549而言，对顺铂明显耐药，此结果与相关文献报道【4】结果相近。CIK对A549的IC50为7.657×105个细胞/mL，对A549/DDP的 IC50为7.995×105个细胞/mL，说明CIK对A549及A549/DDP均有杀伤作用，无统计学意义(P>0.05)。本实验确定CIK对A549/DDP IC10=4.130×105个细胞/mL为CIK细胞作用A549/DDP的无毒剂量，以排除CIK细胞对肺腺癌细胞株的干扰，CIK联合顺铂共同作用后，IC50值分别降至1.743μg/mL、1.336μg/mL、0.883μg/mL，差异有统计学意义(P<0.05)，说明CIK联合顺铂可以提高顺铂对A549/DDP的杀伤活性；计算逆转倍数(FR)分别为(2.369、3.091、4.677)，且逆转倍数随着CIK细胞密度的增加而增大。说明CIK细胞可部分逆转A549/DDP对顺铂的耐药性。其具体是通过何种机制逆转其耐药性的，有待进一步研究证实。

【1】 Chan J K,Hamilton C A,Cheung M K,et al.Enhanced Kiling of primary ovarian cancer by retargeting autologous cytologous cytokine-induced killer cells with bispecific antibodies:a preclinical study【J】.Clin Cancer Res,2006,12(6):1859-1867.

【2】 Schmidt-Wolf I G,Lefterova P,Mehta B A,et al.Phenotypic characterization and identification of effector cells involved in tulmor cell recognition of cytokine-induced killer cells 【J】.Exp Hematol,1993,21(13):1673-1679.

【3】 Linn Y C,Hui K M.Cytokine-induced killer cells:NK-like cells with cytotolytic specificity against leukemia 【J】.Leuk Lymphoma,2003,44(9):1457-1462

【4】 蔡鹏，刘叙仪，韩复生，等.耐顺铂肺癌细胞系A549/DDP的建立及耐药机制【J】.中国肿瘤临床,1995，22(8):582-587.

Studyofthecytotoxicandresistancereversaleffectsofcytokine-inducedkillercellsoncisplatin-resistanthumanlungadenocarcinomacelllineA549/DDP

Liyinglin,Lining,Liran,Tianxin

(The Affiliated Tumor Hospital，The Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Guizhou Zunyi 563099,China )

ObjectiveTo investigate the cytotoxic and resistance reversal effects of cytokine-induced killer cells (CIK) on cisplatin-resistant human lung adenocarcinoma cell line A549/DDP.MethodsThecytotoxicabilityofcisplatin,CIKcellsandcisplatincombinedwithCIKcellswasaccessedbyMTTassayfollowedbydetectingtheresistantindexandthereversalfold.ResultsThere was significant difference of the 50% inhibiting concentration (IC50) value between A549 and A549/DDP cells after cisplatin treatment.The resistant index of A549/DDP to cisplatin was 3.506.Also,CIK had inhibitory effects on A549 and A549/DDP cells and no significant difference was shown between these 2 cells.Furthermore,after A549/DDP cells were pretreated with CIK at the density of 1×105,2×105and 3×105cells/mL and then treated with cisplatin,there were significant difference of IC50 value among these 3 different cell density of CIK cells with the reversal fold of 2.369,3.091 and 4.677,respectively.Conclusion① A549/DDP cells are more resistant to cisplatin than A549 cells.② There was no significant difference of the inhibitory effects of CIK cells on A549 and A549/DDP cells.③ CIK cells combined with cisplatin could increase the cytotoxic ability of cisplatin on A549/DDP cells,suggesting that CIK cells partly reversed the resistance of A549/DDP to cisplatin.

lung cancer;cytokine-induced killer cells;drug resistance;cisplatin-resistant human lung adenocarcinoma cell line A549/DDP;tumor immunotherapy

R734

A

1000-2715(2012)05-0404-03

【收稿2012-05-23；修回2012-09-12】

(编辑：谭秀荣)