反式白藜芦醇对Aβ25-35致痴呆大鼠海马caspase12的影响

程青格,徐 平,龚其海,史艳红,刘 赛,黄艺婧

(1.遵义医学院附属医院 神经内科；2.遵义医学院 药理学教研室,贵州 遵义 563099)

反式白藜芦醇对Aβ25-35致痴呆大鼠海马caspase12的影响

程青格1,徐 平1,龚其海2,史艳红1,刘 赛1,黄艺婧1

(1.遵义医学院附属医院 神经内科；2.遵义医学院 药理学教研室,贵州 遵义 563099)

目的观察反式白藜芦醇(TR)对β淀粉样蛋白(Aβ25-35)致痴呆大鼠海马caspase12 mRNA和蛋白表达的影响，补充说明TR抗痴呆的作用机制。方法大鼠随机分为五组：假手术组、阳性对照组、模型组、低剂量组、高剂量组，每组9只。在大鼠海马给予Aβ25-35造模结束后连续灌胃15 d每日1次，阳性对照组给予多奈哌齐1mg/kg，低剂量给予TR10mg/kg，高剂量TR40mg/kg，假手术组和模型组给予同体积的生理盐水。第15天时处死大鼠，免疫组化及Western blot 检测海马caspase12蛋白表达，实时定量PCR检测海马caspase12 mRNA的表达。结果大鼠注射Aβ25-35后，模型组海马caspase12 蛋白和mRNA表达明显高于假手术组(P<0.01)。TR剂量依赖性地降低了大鼠caspase12蛋白表达和mRNA表达(P<0.05)。结论TR抗Aβ25-35致痴呆大鼠的作用机制与抑制海马caspase12基因表达有关。

反式白藜芦醇 ；Aβ25-35；痴呆；海马；caspase12

阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease，AD)是痴呆最常见的病因，也是常见的神经系统变性疾病,目前发病机制不清楚，也缺乏特异性治疗手段。白藜芦醇属于非黄酮类多酚化合物，治疗实验性AD疗效显著【1】。本课题在既往研究反式白藜芦醇(Trans-Resveratrol，TR)对Aβ25-35诱导痴呆大鼠有效，其机制可能部分与抑制iNOS，caspase8，caspase9 mRNA表达有关，从而抑制海马细胞的凋亡和学习记忆的减退【2，3】。同时海马神经元在受到Aβ刺激后，可上调内质网特异性的Caspasel2凋亡因子表达，启动内质网特异性凋亡途径【4】，内质网通路是细胞凋亡的一条新途径【5】。然而，TR对Aβ25-35致痴呆大鼠海马caspase12有何影响尚不清楚。因此，本研究进一步观察了TR对Aβ25-35诱导的痴呆大鼠海马caspase12表达的影响,补充说明TR抗痴呆的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂及仪器 清洁级SD雄性大鼠，体重300～350 g，由第三军医大学大坪医院医学院实验动物中心野战外科研究所提供，许可证号sexk(渝)2007-0005。Aβ25-35(Sigma公司)，反式白藜芦醇(纯度98%，陕西慈缘生物技术有限公司)， 盐酸多奈哌齐(安理申)【卫材(中国)药业有限公司制造，批准文号：国药准字H20070181】。BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)，caspase12多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)。SABC试剂盒兔抗IgG(武汉博士德生物工程有限公司),β-actin小鼠单克隆抗体(碧云天生物技术研究所)。Caspase12引物由大连宝生物公司合成，见表1。实时荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司)，逆转录仪(德国Eppendorf公司)，脑立体定位仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，电泳凝胶成像分析系统(美国BIO-RAD公司)，Leica Owin细胞图像分析系统(德国leica)。

表1 基因引物序列

1.2 Aβ25-35制备 Aβ25-35用生理盐水解制成1μg/μl溶液，在孵箱里孵育7 d，变成聚集态，使Aβ25-35毒性增加，放在4℃备用。

1.3 动物分组及给药 将大鼠分为5组，假手术组，阳性对照组，模型组，低剂量组，高剂量组，每组9只。制模后每日一次灌胃，阳性对照组给予多奈哌齐1mg/kg，低剂量组给予TR10 mg/kg，高剂量组TR40 mg/kg，假手术组和模型组给予同体积的生理盐水，连续15 d。

1.4 动物模型制备 雄性SD大鼠45只，称重，用10%水合氯醛0.35 mL/100 g体重腹腔注射麻醉后将大鼠固定于脑立体定位仪上，参考包新民【6】“大鼠脑立体定位图谱”及文献，局部头顶去毛消毒正中矢状位切口。将骨膜分离，剥除，确定前后囟，并使之处于同一水面上取前囟左右侧2.5 mm，后5.0 mm，自颅骨表面进针3.5 mm深处，用微量注射器注入Aβ25-35每侧5μg，留针5min，缝合。假手术组给予等体积的生理盐水，余操作同上。术后给予青霉素预防感染。

1.5 取材 制模15 d后，每组随机抽取3只大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉后打开胸腔，暴露心脏，用大头针刺入左心室进如主动脉，剪开左心耳，灌注100 mL PBS，然后灌入100 mL 4%多聚甲醛固定，断头取脑，放入4%的多聚甲醛用于免疫组化检测。剩余大鼠麻醉后断头取脑，剥出海马组织，右侧海马放于EP管中，用于Western blot检测，左侧海马放于盛有Trizol的去酶EP管中，用于PCR检测，-80℃保存备用。

1.6 免疫组织化学法 切片后梯度脱水，Caspase12一抗1∶50稀释，4℃冰箱孵育过夜(采用PBS代替一抗作阴性对照)。再加入生物素标记的二抗，采用SABC法测定海马中Caspase12蛋白表达，具体方法参见说明书，用新鲜配制的DAB溶液显色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片后于显微镜下观察并摄片。

1.8 RT-PCR法测定 取左侧海马组织，提取、纯化RNA，测定RNA含量，逆转录及扩增均按试剂盒说明书进行。1 mLTrizol匀浆加200 μl氯仿，用手振荡15 s，12 000 g，4℃，离心15 min， 将上清液移至另一去酶EP管中，加等量异丙醇，沉淀RNA。结果分析处理采用相对定量法，Ct值为统计参数依次计算下列数据，Ct平均值=(Ct1+Ct2)/2，dCt=Ct平均值-中间值，基因的表达=2^(-dCt)，相对定量=目的基因的表达/内参基因的表达。

2 结果

2.1 TR对大鼠海马caspase12蛋白表达的影响 免疫组化法定位测定了大鼠海马caspase12蛋白的表达。结果显示，在海马CA1区均可见阳性反应产物，颜色呈棕褐色或棕黄色，主要集中在胞膜和胞浆位置。假手术组大鼠海马CA1区锥体细胞着色不明显，仅有少数细胞胞浆呈棕黄色(见图1A)；模型组锥体细胞阳性染色范围广，染色深，呈棕褐色(见图1C)；低剂量组细胞胞浆染色相对模型组染色比较浅，为浅褐色(见图1D)；阳性对照组和TR高剂量组阳性表达明显减少，阳性着色为浅褐色(见图1B，E)。

为进一步直观分析TR对大鼠海马神经元caspase12蛋白表达的影响，本研究同时采用Western blot法检测了其表达。结果表明，模型组海马Caspase12蛋白表达明显高于空白组(P<0.01)，TR低剂量、高剂量组和阳性药治疗组海马caspase12蛋白的表达较模型组明显减少，TR成剂量依赖性降低了海马caspase12蛋白的表达(P<0.05)。结果(见图2，图3)。

注： A:假手术组B:阳性对照组 C:模型组D:TR低剂量组E:TR高剂量组。图1 TR对Aβ25-35所致痴呆大鼠海马caspase12蛋白表达的影响(×400)

注：A:假手术组B:阳性对照组 C:模型组D:TR低剂量组E:TR高剂量。图2 TR对Aβ25-35所致痴呆大鼠海马caspase12蛋白表达的影响

2.2 TR对大鼠海马caspase12 mRNA表达的影响为了深入分析TR抑制痴呆大鼠海马caspase12蛋白表达的可能机制，本研究进一步采用RT-PCR法检测了海马caspase12 mRNA的表达。结果表明，大鼠注射Aβ25-35后，模型组海马caspase12 mRNA的表达明显高于假手术组(P<0.01)，阳性对照组海马的caspase12 mRNA的表达明显低于模型组(P<0.01)，TR 剂量依赖性地降低了大鼠caspase12 mRNA的表达(P<0.05，P<0.01)。结果(见表2)。

注：与假手术组比较 ##P<0.01 ；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。图3 TR对Aβ25-35诱导的模型大鼠海马caspase12蛋白表达影响的定量结果

表2 TR对Aβ25-35诱导的模型大鼠海马caspase12 mRNA表达的影响

注：与假手术组比较##P<0.01 ；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。

3 讨论

AD发生的中心环节是β淀粉样蛋白沉积和老年斑的形成，老年斑形成的主要物质是β淀粉样蛋白，AD发生的重要因素是β淀粉样蛋白沉积【7】。大鼠海马注射Aβ25-35是诱导痴呆模型最常用的方法之一。本研究组既往研究发现，在Aβ25-35诱导的大鼠痴呆模型中，其海马iNOS，caspase8，caspase9 mRNA表达明显增高【2.3】。同时有研究表明Aβ引起神经细胞凋亡可能主要通过caspases依赖性途径【8】。本研究发现Aβ25-35海马内注射增加了caspase12蛋白及其mRNA表达。caspase12作为caspases家族成员之一，位于内质网胞质面，以无活性pro-caspase12存在，内质网应激引起将其激活，最终引起细胞凋亡【9】。

治疗痴呆的药物目前主要为胆碱酯酶抑制剂，本研究选用多奈哌齐作为阳性对照，观察了TR对痴呆大鼠海马caspase12表达的影响，发现TR与多奈哌齐均能抑制Aβ25-35诱导的大鼠海马caspase12蛋白及其mRNA表达，这不仅拓展了对阳性药多奈哌齐抗痴呆作用机制的认识，而且发现TR具有与阳性药类似的作用。非常有趣的是，TR抑制Aβ25-35诱导的大鼠海马caspase12蛋白及其mRNA表达作用存在剂量依赖性。白藜芦醇可分为顺式和反式两种，TR比顺式白藜芦醇活性要高，主要有抗氧化，抗炎，类雌激素样等作用【10，11】。TR防治AD的研究数见报道【12】，本研究进一步发现了TR防治AD的作用机制至少与其抑制大鼠海马caspase12的基因表达有关。

【1】 龚其海，杨丹莉，石京山，等.白藜芦醇减轻慢性神经炎症所致的大鼠空间学习记忆减退【J】.中国新药杂志,2011,20(18):1817-1821.

【2】 王顺旺，徐平，刘海军，等.反式白藜芦醇对Aβ25-35致痴呆大鼠海马诱导型一氧化氮表达的影响【J】.重庆医学,2010,39(18):2400-2405.

【3】 陈群,徐平,王顺旺，等.反式白藜芦醇对Aβ25-35损伤大鼠海马旁回caspase8,caspase9的影响【J】.中国生化药物杂志,2011,2(2):115-118.

【4】 罗红波，杨金升,石向群，等.Aβ诱导内质网应激性凋亡通路的启动及二苯乙烯苷的影响【J】.东南大学学报：医学版,2011,30(6):855-860.

【5】 李蕊君，何昆仑，李 鑫，等.Grp78和caspase-12在缺氧心肌细胞中的表达【J】.军医进修学院学报,2011,32(3):270-272.

【6】 包新民，舒斯云．大鼠脑立体定位图谱【M】．北京：人民卫生出版社,1991.30-34.

【7】 Torreilles F，Touchon J.Pathogenic theories and intrathecal analysis of the sporadic form of Alzheimer s disease【J】.Progess in Neurobiology，2002，66(3)：191-203.

【8】 Clementi M E，Pezzotti M，Orsini F，et al.Alzheimer’s amyloid β-peptide(1-42) induces cell death in human neuroblastoma via bax/bcl-2 ratio increase:An intriguing role for methionine 35【J】.Biochem Biophys Res Commun，2006，342(1)：206-213.

【9】 Ron D，W alter P.Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response l 【J 】.Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8(7)：519-529.

【10】 刘彝，陈清，郭江，等.白藜芦醇对脂多糖诱导的星型胶质细胞炎症损伤的保护作用【J】.南方医科大学学报,2011,31(12)：2052-2056.

【11】 Kubota S，Kurihara T，Mochimaru H，et a1.Prevention of ocular inflammation in endotoxin-induced uveitis with resveratrol by inhibiting oxidative damage and nuclear factor-kappaB activation 【J】.Invest Ophthalmol Vis Sci,2009,50(7):3512-3519.

【12】 Li F,Gong Q,Dong H,Shi J.Resveratrol,a neuroprotective supplement for Alzheimer's disease【J】.Curr Pharm Des.2012,18(1):27-33.

Effectsoftrans-resveratrolonhippocampuscaspase12expressioninAβ25-35-induceddementiarats

Chengqingge1,Xuping1,Gongqihai2,Shiyanhong1,Liusai1,Huangyijing1

(1.Department of Neurology,the Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Guizhou Zunyi,563000 China;2.Department of Pharmacology,Zunyi Medical College,Guizhou Zunyi,563099 China)

ObjectiveTo observe the effects of tran-resveratrol (TR) on hippocampus caspase12 mRNA and protein expressions in Aβ25-35-induced dementia rats and further explore the anti-dementia mechanisms of trans-resveratrol.MethodsRats were randomly divided into sham,positive control (donepezil),model (Aβ25-35),low- and high-dose of TR groups,respectively (n=9).After the injection of Aβ25-35into hippocampus,rats were administrated with 1.0 mg/kg donepezil and 10 and 40 mg/kg TR once daily by gavage for consecutive 15 days,while sham and model groups were administrated with volume-matched normal saline by gavage.After the final treatment,all the rats were sacrificed and caspase12 protein expression was examined by immunohistochemistry and western blotting assay and caspase12 mRNA expression was detected by real time PCR in rat hippocampus.ResultsCompared with the sham group,Aβ25-35increased the protein and mRNA expressions of caspase12 in rat hippocampus (P<0.01).Compared with the model group,TR treatments significantly decreased the protein and mRNA expressions of caspase12 in rat hippocampus in dose-dependent manner (P<0.05).ConclusionThe mechanisms underlying TR-mediated anti-dementia induced by Aβ25-35might be,at least partly,due to the decreased expression of caspase12 in rat hippocampus.

trans-resveratrol;Aβ25-35;dementia;hippocampus;caspase12

贵州省科技厅社发攻关项目(NO：黔科合SY字【2010】3074)。

徐平,男，博士，教授，研究方向：神经病学，E-mail:xuping527@vip.sina.com。

R96;Q949.745

A

1000-2715(2012)05-0379-04

【收稿2012-05-27；修回2012-09-12】

(编辑：谭秀荣)