中药绞股蓝改善血管性痴呆小鼠认知功能障碍

祁敏芳，罗灿烂，秦 伟，田 虹，陈远寿

(遵义医学院 生理学教研室， 贵州 遵义 563099)

中药绞股蓝改善血管性痴呆小鼠认知功能障碍

祁敏芳，罗灿烂，秦 伟，田 虹，陈远寿

(遵义医学院 生理学教研室， 贵州 遵义 563099)

目的探讨绞股蓝对血管性痴呆(VD)小鼠认知功能障碍和海马神经元损伤的保护作用。方法随机将雄性C57BL6/G小鼠分为假手术(Sham)组、血管性痴呆模型(VD)组、绞股蓝治疗组(低、中、高剂量组)。采用双侧颈总动脉阻断(2VO)方法复制血管性痴呆小鼠模型，Morris水迷宫检测小鼠的学习记忆能力，HE染色法观察小鼠海马神经元的形态学变化。结果Morris水迷宫测试发现VD小鼠学习记忆能力下降，海马CA1区神经元迟发性死亡；绞股蓝治疗可显著提高VD小鼠的学习记忆能力，减少VD所致的海马CA1区神经元死亡；中、高剂量绞股蓝治疗组VD小鼠逃避潜伏期的时间明显短于低剂量组，穿越平台次数明显多于低剂量组，其差异具有统计学意义(P<0.05)。结论绞股蓝可通过保护血管性痴呆所致的小鼠海马神经元损伤，改善VD小鼠的认知功能。

绞股蓝；血管性痴呆；认知功能；小鼠

血管性痴呆(vascular dementia,VD)是因各种脑血管疾病而引发的脑功能缺失，从而出现大脑认知、学习、记忆等功能障碍的临床综合征，血管性痴呆多发生在反复发作的脑血管疾病的老年人，是老年性痴呆的常见病因之一，随着我国人口的老龄化，血管性痴呆的发病率逐年增加【1】。研究表明，海马是脑缺血再灌注并发的血管性痴呆的易损中枢，并且是学习、记忆、认知功能的关键部位。因此，海马组织在脑缺血状态下很容易发生生理、生化、病理形态学等方面改变，从而引起脑功能的认知障碍【2,3】。从中医角度来看，血管性痴呆的病机为“气虚血瘀”。中药绞股蓝(Gprostemma Pentaphyllum Makino,GP)性寒、味甘、微苦【4】。其有效成分之一绞股蓝总皂苷具有抗氧化、抗疲劳、免疫调节、降血脂、延长细胞寿命等作用，几乎无任何毒性【5】。并且在神经药理方面表现出较强的神经活性作用【6,7】。研究证明中药绞股蓝总皂苷在脑缺血再灌注中具有清除氧自由基，抗脂质过氧化，增加组织血流量，抑制钙超载，加快血流速度及增加脑动脉侧支循环等作用【8】。本研究旨在观察中药绞股蓝对血管性痴呆小鼠的神经保护作用以及认知功能障碍的改善作用，为临床上治疗血管性痴呆引起的学习、记忆、认知障碍提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康雄性C57BL6/G小鼠，体重在(25±2)g，由第三军医大学动物实验中心提供(清洁级)。小鼠随机分为假手术(Sham)组、VD模型组，绞股蓝治疗低、中、高剂量组，每组12只。

1.2 试剂与仪器 绞股蓝(西安嘉天生物科技有限公司，批号TS-02-128-1，纯度99%)。MT-200Morris水迷宫(四川成都泰盟科技有限公司提供)。

1.3 实验方法

1.3.1 建立模型及给药方法 应用2VO方法建立血管性痴呆小鼠模型。小鼠术前禁食8 h，禁水4 h。10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射将小鼠麻醉，在小鼠颈部做正中切口，沿两侧胸锁乳突肌内侧缘钝性分离出左右两侧颈总动脉(CCA)，0号线挂过，用动脉夹夹闭双侧颈总动脉造成脑组织缺血，夹闭10 min，再灌注20min，反复3次，之后碘伏消毒并逐层缝合切口，术后用80万U青霉素抗感染治疗3 d。sham组只进行双侧颈总动脉的分离，不进行缺血再灌注的夹闭。术前3 d、术后28 d分别给药物组小鼠低、中、高剂量100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg的绞股蓝总皂苷稀释液，每天早晨腹腔注射1次，疗程为28 d，Sham组和VD模型组小鼠按等容量生理盐水腹腔注射，次数及疗程同药物组。

1.3.2 小鼠空间学习与记忆能力的测定 Morris水迷宫系统是特殊的动物高级神经生理反应能力测试装置，利用并记录动物的行为学(游泳)表现，依据动物本能反应和条件记忆，应用在大鼠、小鼠学习记忆机制的研究。Morris水迷宫是一个直径约为100 cm的圆形水池，水深约33 cm，水温保持在(23±1)℃,平台高度约30 cm，平台顶端的平面6 cm×6 cm，将平台没于水下3～4 cm，在实验过程中，水池周围的参照物保持不变，水池分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4个象限，分别设有4个放小鼠入水的起点，各组小鼠在术前与术后28 d行Morris水迷宫实验【9】，实验分为前5d的定位航行实验与第6 d的空间探索实验。

1.3.2.1 定位航行实验 历时5 d,实验前1 d先将每只小鼠放入水中进行适应性训练，再将小鼠放在平台上停留20 s,使其对平台产生记忆，实验总时间为120 s，实验过程中有图像自动监视系统追踪小鼠的游泳轨迹，并记录小鼠跳上平台的时间。每只小鼠每天分别从4个不同象限放入水中，每个象限各放入一次，取平均值做为每天逃避潜伏期。实验中，小鼠在120 s内跳上平台并停留3 s后，做为一次记录，若未在120 s内跳上平台的小鼠将采用人为引导的方式将其放在平台上并停留3 s,记录时间为120 s，每组小鼠在经历一个象限的实验后休息20 min，再进入下一个象限的实验。

1.3.2.2 空间探索实验 在实验进行的第6 d，撤去水池中的平台，在同一入水点将小鼠面朝池壁放入水中，Morris水迷宫系统自动记录其在120 s内跨过原平台相应位置的次数。

1.3.3 病理学观察 在造模后的3 d，随机取各组小鼠，麻醉后灌注固定，升主动脉进行生理盐水冲洗、40%的多聚甲醛灌注，之后断头取脑，分别15%、30%蔗糖依次脱水，见脑组织沉底，最后40%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，行海马连续冠状切片(3μm)，HE染色，显微镜下观察海马神经元形态学变化。

2 结果

2.1 绞股蓝提高VD小鼠的学习记忆能力

2.1.1 定位航行实验 历时5 d，随着训练次数的增多，各组小鼠逃避潜伏期都有不同程度的缩短，在术后28 d，VD模型组小鼠的逃避潜伏期明显比Sham组时间长(P<0.01)；绞股蓝治疗组小鼠逃避潜伏期明显比VD模型组时间短(P<0.05)；绞股蓝中、高剂量组逃避潜伏期明显比低剂量组时间短(P<0.05)；绞股蓝中、高剂量组之间无显著差异(P>0.05)(见表1)。

表1 各组小鼠定位航行实验逃避潜伏期比较

注：*P<0.05与Sham 组比较，**P<0.01与Sham 组比较；▽P<0.05与 GP 中、高剂量组比较，#P<0.05与GP低剂量组比较。

2.1.2 空间探索实验 术前Sham组、VD模型组、GP低、中、高剂量组穿越平台次数差异无统计学意义(P>0.05)；术后28 d，VD模型组穿过平台次数明显少于Sham组(P<0.01)；VD模型组穿过平台次数明显少于GP低、中、高剂量组(P<0.05)；GP中、高剂量组穿过平台次数明显比低剂量组多(P<0.05)，(见表2)。

2.2 绞股蓝可保护VD所致小鼠海马神经元损伤Sham组CA1区海马神经元细胞数目多，排列整齐紧密，细胞核呈圆形或椭圆形(见图1A)； VD模型组小鼠海马神经元胞浆出现片状坏死，海马神经细胞数目明显减少，排列紊乱松散，细胞核固缩深染，细胞核边界模糊(见图1B)。而GP中、高剂量组海马神经元细胞层次较清楚，排列较整齐，海马神经元细胞数量明显增多，细胞核固缩深染现象少见(见图1D、E)。

表2 各组小鼠空间探索实验穿越平台次数比较

注：*P<0.05与Sham 组比较；**P<0.01 与 Sham组比较；▽P<0.05 与 GP 中、高剂量组比较.#P<0.05与GP低剂量组比较。

图1 绞股蓝对VD小鼠海马神经元损伤的影响(HE×200)

3 讨论

反复发生的慢性脑缺血再灌注损伤是引发血管性痴呆(VD)的病理生理学基础，而学习记忆认知功能的障碍又是VD的主要临床症状，Morris水迷宫是国内外常用的检测小鼠认知功能障碍的主要装置【10】，本实验通过定位航行实验和空间探索实验来检测小鼠的行为学能力，定位航行实验反映小鼠的空间认知能力；空间探索实验则反映小鼠空间记忆的能力。因而说明小鼠找到安全平台的时间越短，穿越原位平台的次数越多，小鼠的认知功能越强。本实验结果表明，血管性痴呆模型组小鼠找到平台的所用时间明显比正常组和绞股蓝药物组延长，穿越原位平台次数比正常组和绞股蓝药物组明显减少，说明模型组小鼠出现了学习认知功能障碍的行为学表现。

现在已有实验发现脑缺血再灌注引发的血管性痴与脂质过氧化、氧自由基和谷氨酸的释放、Ca2+超载等机制有关，从而诱导海马神经元细胞的凋亡，而绞股蓝总皂苷在脑缺血再灌注损伤中具有抗氧化作用，提高体内抗氧化酶的活性，使超氧化物歧化酶(SOD)的含量显著增高，丙二醛(MDA)的含量显著降低，抑制氧自由基的形成来保护脑组织，减轻因过氧化引起的脑损伤【11-13】，通过本次试验发现GP药物组可明显改善脑缺血再灌注后海马神经元的病理表现及小鼠的认知记忆能力，但针对绞股蓝改善血管性痴呆小鼠认知功能的分子生物学机制仍有待于我们进一步的实验研究。

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【3】Deng W,Aimone Baggage F H.New neurous and new memories:how does adult hippocampus neurogenesis affect learning and memory【J】.Nat Rev neurosci,2010,11(5):339-350.

【4】张永,丁国华,张建鄂,等.绞股蓝总皂苷对单侧输尿管结扎大鼠肾组织结缔组织生长因子表达的影响【J】.实用医学杂志,2005,21(16):1745-1747.

【5】沈宏伟,肖彦春,车仁国，等.绞股蓝化学成分研究的现状【J】.时珍国医国药，2008 19(7)：1561-1564.

【6】Hu Y,Epic,Fu G,et al Dammarance saponins form Gynostemma pentaphyllum 【J】.Phytochemistry,2010,71(10):1149-1157.

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【8】张岫美，魏欣冰.绞股蓝总皂苷对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的抗氧化作用【J】.山东医科大学学报，2002,40(1)：7-9.

【9】杨天鹏,唐敏,刘巧琼,等.丁香酚通过嗅觉通路改善昆明鼠学习记忆的机制【J】.中国康复医学杂志，2007,20(6):487-489.

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【13】Jia J,Hu Y S,Wu Y,et al.Pre-ischemic treadmill training affects glutamate and gamma amino butyric acid levels in the striate dialyses of a rat model of cerebral ischemia【J】.Lief Sci,2009,84(15/16):505-511.

Gynostemmaimprovesvasculardementia-inducedcognitivedysfunctioninmice

Qiminfang,Luochanlan,Qinwei,Tianhong,Chenyuanshou

(Department of Physiology,Zunyi Medical College,Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo investigate the neuroprotective effects of gynostemma on vascular dementia-induced cognitive dysfunction and neuronal injury in mouse hippocampal CA1 region.MethodsC57BL/6 mice were randomly divided into sham-operation group (control),the vascular dementia (VD) group and gynostemma-treated (low,medium and high dose) groups.The mouse vascular dementia model was induced by bilateral common carotid artery occlusion (2VO).Morris water maze was used to measure mouse learning and memory ability.The neuronal injure in mouse hippocampal CA1 region was detected by HE staining.ResultsThe Morris water maze test showed that vascular dementia induced the decreased spatial learning and memory ability and the delayed neuronal death in hippocampal CA1 region.Gynostemma treatment significantly improved cognitive dysfunction and reduced neuronal death in hippocampal CA1 region of VD mice.In addition,compared with the low dose of gynostemma group,the reduced escape latency and the increased times of crossing the platform were detected in high and medium doses of gynostemma groups.ConclusionGynostemma could produce neuroprotective effects against VD-induced mouse cognitive dysfunction and neuronal injury.

gynostemma;vascular dementia;cognitive function;mouse

贵州省科学技术基金资助项目(NO：J20122351)；遵义医学院重点学科建设经费资助项目(NO：20121602)。

陈远寿，男，教授，研究方向：神经疾病生物学，E-mail:jcbshengli@163.com。

R743.31

A

1000-2715(2012)05-0371-04

【收稿2012-06-22；修回2012-08-20】

(编辑：谭秀荣)