UrocortinⅠ对缺氧/复氧损伤心肌细胞钙离子的影响

张 琳，邓胜利，姚 刚，喻 田

(遵义医学院 麻醉系，贵州 遵义 563099)

UrocortinⅠ对缺氧/复氧损伤心肌细胞钙离子的影响

张 琳，邓胜利，姚 刚，喻 田

(遵义医学院 麻醉系，贵州 遵义 563099)

目的观察UcnⅠ对成年大鼠缺氧/复氧损伤心肌细胞钙离子的影响。方法通过Langendorff离体心脏灌注系统，用Ⅱ型胶原酶逆行灌注法分离成年大鼠心肌细胞，培养20 h后随机分为正常组(N组)、缺氧/复氧组(I/R组)、UrocortinⅠ组(UcnⅠ组)、5-羟葵酸+UrocortinⅠ组(5-HD+ UcnⅠ组)。各处理组心肌细胞加入Fluo-3/AM荧光探针，用激光共聚焦显微镜检测细胞内钙的荧光强度。结果I/R组心肌细胞内钙离子浓度较N组高(P<0.05)，UcnⅠ组较N组荧光强度明显增强(P<0.01)，而5-HD+ UcnⅠ组心肌细胞内钙离子荧光强度与UcnⅠ组比较明显降低(P<0.05)。结论UcnⅠ可使成年大鼠缺氧/复氧损伤心肌细胞内钙离子浓度升高，5-HD则可阻断UcnⅠ的作用，提示UcnⅠ导致缺氧/复氧后心肌细胞钙离子浓度的升高可能跟ATP敏感性钾通道开放有关。

缺氧/复氧损伤；UrocortinⅠ；钙离子；心肌细胞

近年来抗心肌缺血再灌注损伤一直是临床所关注的热点，如何减轻心肌缺血再灌注损伤具有重大的临床意义。UrocortinⅠ是一种含有40个氨基酸并由垂体合成的神经肽，目前已经证实UcnⅠ可在心脏中表达，并能增强心肌收缩力，提高心率，增加心排量，对心血管系统具有强而持久的调控作用，同时也具有抗缺血再灌注损伤作用[1,2]，但其具体机制仍然不清。本实验拟通过用激光共聚焦显微镜，观察UcnⅠ对缺氧/复氧损伤心肌细胞内钙离子浓度的影响，来探讨UcnⅠ抗缺血再灌注损伤作用的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级成年SD大鼠,16～20wk，质量200～350 g，雌雄不拘,由第三军医大学提供( SCXK(军) 2007-017) 。

1.1.2 主要试剂与仪器 Ⅱ型胶原酶(美国Gibco公司)；UrocortinⅠ、5-羟葵酸、EGTA、M199、BSA、层粘连蛋白(美国 Sigma公司)；Fluo-3/AMester(Biotium公司)，其他试剂为国产分析纯。SP2型激光共聚焦显微镜(莱卡公司，德国)，全自动数码成像与分析系统(GenGenius,Syngene,USA)，MPA离体心脏灌注装置ALC-B5恒流泵SIGO双通道灌注仪(上海)；二氧化碳培养箱(美国Forma)；纯水处理器(美国Millipore)。

1.2 方法

1.2.1 成年大鼠心肌细胞的分离与培养 利用Langendorff离体心脏灌注装置，成年大鼠心肌细胞的分离与培养参照文献[3]的方法并加以改进,主要步骤如下：大鼠腹腔注射3﹪戊巴比妥钠40 mg·kg-1、肝素50U·kg-1麻醉与肝素化；迅速开胸取出心脏，放入预冷的750 μM Ca2+液(4 ℃)中轻柔挤压心脏2～3次；后迅速将主动脉根部固定于Langendorff灌注管口(设置灌注流量为 9 mL/ min/ g 心脏)；37℃下分别依次逆行灌注充氧的750 μM Ca2+液、无Ca2+EGTA液、Ⅱ型胶原酶液。将灌注后的心脏沿心底向心尖剪下并在无菌摇瓶里加入含有BSA的循环Ⅱ型胶原酶液，37℃恒温水浴箱振荡消化，160钼滤网过滤，自然沉降后收集细胞，在沉淀中加入新鲜的酶洗脱液洗脱3次，在培养基中洗脱2次；将沉淀滴片，在相差倒置显微镜下行细胞计数，按镜下细胞密度=细胞数/毫升原液=(4大格细胞数之和/4)×104×稀释倍数；用台盼兰进行细胞染色，观察细胞活性，有典型横纹、活力的杆状细胞约占80%以上可用于后续在M199培养基中进行培养。将细胞数以104/cm2的密度平铺于层粘连蛋白( 37℃0.5 h) 预处理过的6 孔板中,加入无血清M199 培养3 h 使之贴壁,再小心换液。

1.2.2 实验分组与各因素处理 细胞培养20 h后，将心肌细胞随机分为4组进行处理：正常组(N组)在37℃95%O2+5%CO2培养箱中持续培养420 min；缺氧/复氧组(I/R组)：正常培养60 min后，在95% N2+5%CO2培养箱中缺氧240 min，再复氧120 min；UrocortinⅠ组(UcnⅠ组)正常培养30 min+ UcnⅠ(10-8M)30 min；5-羟葵酸+UrocortinⅠ组(5-HD+ UcnⅠ组)5-HD(5×10-9mol/L)30 min+UrnⅠ(10-8M)30 min培养，余处理同I/R组，在95%N2+5% CO2培养箱中缺氧240 min，再复氧120 min。

1.2.3 共聚焦显微镜测定心肌细胞内钙离子浓度室温避光条件下，将复氧后心肌细胞用Fluo-3/AM (10 mg/L )Ca2+荧光染料在37℃培养箱中负载约45 min。PBS 液轻柔冲洗细胞2～3次以洗去多余的荧光染料，通过激光共聚焦显微镜，选择8个不同视野观察30个细胞内钙离子荧光强度，采用激光共聚焦显微镜分析软件测量细胞内钙离子荧光强度的变化。

2 结果

N组细胞内钙离子荧光强度较低；I/R组心肌细胞内钙离子荧光强度较N组强(P<0.05)；UcnⅠ组较N组荧光强度明显增强(P<0.01)；5-HD可拮抗UcnⅠ使细胞内钙离子荧光强度降低(P< 0.05)。激光共聚焦显微镜下各组心肌细胞内Ca2+荧光强度见图1,各组荧光强度数值比较(见表1)。

表1 缺氧复氧后各组心肌细胞内Ca2+荧光强度值

注：与 N组比较,*P<0.05,P<0.01;与UcnⅠ组比较,#P<0.05。

注：A：N组，B：I/R组，C：UcnⅠ组，D：5-HD+ UcnⅠ组。图1 激光共聚焦显微镜下心肌细胞内Ca2+荧光强度(×400倍)

3 讨论

心肌细胞缺氧/复氧可导致再灌注损伤。目前认为其机制可能与细胞能量代谢障碍、氧自由基产生、钙超载等有关。而钙超载可能是缺血再灌注损伤的重要原因之一。钙离子可作为第二信使传递细胞间的信息。在生理状态下，细胞外游离Ca2+浓度为1～2 mmol/L，而胞内为10～100 nmol/L左右，并主要分布在内质网/肌浆网、细胞核、线粒体和质膜上[4]。而心肌细胞内钙离子的动态平衡主要由以下方式参与调节：1、外钙内流，细胞膜上L型钙离子通道是电压依赖性钙通道，是钙内流的重要途径，L型钙离子通道内流的钙占10%～20%；2、肌浆网储存钙释放，心肌细胞钙超载主要取决于肌浆网内钙离子的释放，细胞浆内Ca2+升高80%～90%由肌浆网释放，舒张期细胞内70%～75%的Ca2+同样由肌浆网上钙泵回收储存[5]。

研究发现，UCN在离体和在体试验中发挥多种心血管作用，如正性肌力作用、抗心衰，提高心率及舒张外周血管、降低血压，抗缺血再灌注损伤，逆转血管重构等[6,7]。本实验采用离体培养成年大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型，利用激光共聚焦显微镜检测细胞内钙离子荧光强度，研究结果显示：I/R组细胞内钙离子荧光强度较N组强，说明缺氧/复氧后心肌细胞内Ca2+浓度增加；UcnⅠ组较N组荧光强度明显增强，说明预处理UcnⅠ后也能使缺氧/复氧后心肌细胞内Ca2+浓度增加。但既往有文献报道：urocortin后处理可减少缺血再灌注损伤心肌细胞内Ca2+浓度增高[8]。Urocortin还能通过抑制心肌细胞L型钙通道的开放抑制细胞内钙超载[9]。这与我们结果不同，原因可能是：UcnⅠ可通过抑制心肌细胞膜上的L型钙通道开放从而阻止钙内流，但不能作用于心肌细胞内内质网本身储存钙的释放，而我们离体培养的成年大鼠心肌细胞是在无钙的M199中培养，所以L型钙通道对细胞内钙水平并无作用，UcnⅠ处理心肌细胞后胞内钙离子浓度依然升高。但5-HD可拮抗UcnⅠ的作用使细胞内钙离子荧光强度降低，而5-HD是线粒体钾通道特异性阻断剂，可说明UcnⅠ对细胞钙离子浓度的影响可能与线粒体ATP敏感性钾通道有关。Lawrence等[10]通过基因芯片技术也发现urocortin无论在体外培养的心肌细胞还是离体心脏，都可使心肌Kir 6.1(ATP敏感性钾通道亚基)表达增加，这也证实了urocortin可通过ATP敏感性钾通道发挥其作用。本实验支持这一推论，但具体的机制还需进一步的实验研究。

综上所述，UcnⅠ可使成年大鼠缺氧/复氧损伤心肌细胞内钙离子浓度升高，但是否是在保护范围内升高，还需进一步实验来验证。而5-HD可阻断UcnⅠ此作用，说明UcnⅠ对钙离子浓度的影响可能跟ATP敏感性钾通道开放有关。

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[5]李悟，李彤，杨景学，等.家兔未成熟心肌缺血再灌注肌浆网摄钙功能的初步研究[J]．中国现代医学杂志，2003,13(16)：23-25.

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EffectsofUrocortinⅠoncalciumconcentrationinhypoxia/reoxygenation-injuredratcardiomyocytes

Zhanglin,Dengshengli,Yaogang,Yutian.

(Department of Anesthesiology,Zunyi Medical College,Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo investigate the effects of Urocortin I (UcnⅠ) on calcium concentration of cultured adult rat cardiomyocytes after hypoxia/reoxygenation injury.MethodsAdult rat cardiomyocytes were separated and cultured by type II collagenase retrograde perfusion using Langendorff isolated heart perfusion apparatus.Twenty hours later,the cardiomyocytes cells were randomly divided into normal group (N),hypoxia/reoxygenation group (I/R),UrocortinⅠgroup (UcnⅠ) and 5-HD+UrocortinⅠgroup (5-HD+ UcnⅠ).The cultured cardiomyocytes were mixed with Fluo-3/AM fluorescent probe and the calcium concentrations of cultured cardiomyocytes were detected via the confocal microscope.ResultsThe inflorescence intensity of intracellular calcium in I/R and Ucn I groups was higher than that in N group (P<0.05).However,the inflorescence intensity of intracellular calcium in 5-HD+UcnⅠgroup was much lower than that in UcnⅠgroup (P<0.05).Conclusion5-HD could block Ucn I-induced increase of intracellular calcium concentration in the cultured adult rat cardiomyocytes after hypoxia/ reoxygenation injury,suggesting that Ucn I-increased calcium concentration in hypoxia/reoxygenation-injured cardiomyocytes might be related to ATP sensitive potassium channel opening.

Hypoxia/reoxygenation injury; UrocortinⅠ; calcium; cardiomyocyte

贵州省科学技术基金项目(NO:黔科合J字[2008]2196);遵义医学院科研启动基金( NO:[2010]448)。

邓胜利，男，副教授,E-mail:zyds12004@163.com。

R331

A

1000-2715(2012)03-0193-03

[收稿2012-03-24；修回 2012-04-12]

(编辑：谭秀荣)