Graves′病患者外周血T细胞表面膜型CD 28及血清中可溶性CD 28的表达及其意义

王凤鸣沈双李琼 刘彤 孙静

1.江苏省常州市疾病预防控制中心，江苏常州 213022；2.苏州大学医学生物技术研究所，江苏苏州 215007；3.江苏省血吸虫病防治研究所，江苏无锡 214000

Graves′病患者外周血T细胞表面膜型CD 28及血清中可溶性CD 28的表达及其意义

王凤鸣1,2沈双2,3李琼1刘彤2孙静2

1.江苏省常州市疾病预防控制中心，江苏常州 213022；2.苏州大学医学生物技术研究所，江苏苏州 215007；3.江苏省血吸虫病防治研究所，江苏无锡 214000

目的分析Graves′病（Graves′disease，GD）患者外周血T细胞表面膜型CD28及血清中可溶性CD28的表达水平，探讨CD28分子在GD免疫病理机制中的作用。方法选取105例GD患者为试验组，67例健康者为对照组，通过溶血及流式细胞术检测所有受试对象外周血T细胞表面膜型CD28的表达，酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中可溶性CD28的含量。结果试验组外周血CD4+CD28+T细胞为（23.367±8.562）%，CD8+CD28+T细胞为（10.156±3.114）%，较对照组[分别为（30.786±5.143）%和（17.200±3.624）%]显著减少（P＜0.0.5、P＜0.0.1），血清中可溶性CD28水平观察组[（2.35±0.58）μg/L]较对照组[（0.53±0.23）μg/L]显著增加（P＜0.01）。结论共刺激分子CD28很有可能参与了GD的免疫病理机制。

膜型CD28；可溶性CD28；Graves′病

Graves′病（GD）是一种自身免疫性甲状腺疾病（auto-immune thyroid disease，AITD），目前认为其发病机制主要是由于细胞表面的促甲状腺激素受体（thyroid stimulating hormone receptor，TSHR）作为自身抗原诱导产生的促甲状腺激素受体抗体（thyrotropin receptor antibody，TRAb）与TSHR结合，甲状腺细胞活化而引起的甲状腺功能亢进[1]。CD28作为CD28/B7超家族的共刺激分子，在GD免疫病理机制中的生物学作用受到很多学者的关注。CD28分子表达在人类95%的CD4+T细胞及50%CD8+T细胞表面，参与T细胞的活化、增殖、分化及发挥免疫效应功能。本文就GD患者外周血T细胞表面膜型CD28的表达及血清中可溶性CD28的水平进行了分析，进而探讨该分子在GD免疫病理机制中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2009年1月～2010年12月在苏州市立医院本部和苏州大学附属第一人民医院门诊和住院的GD患者105例作为试验组，其中男18例，女87例；年龄（38.04±13.16）岁。同时从苏州市立医院本部和苏州大学附属第一人民医院健康体检者中选取同一时期的67例年龄和性别与实验组相匹配的健康受试者作为对照组，其中男10例，女57例；年龄（37.36±9.54）岁。GD的诊断标准为：高代谢症候群，甲亢诊断成立；触诊和B超检查证实有甲状腺肿大，呈弥漫性；伴或不伴浸润性突眼；TRAb和甲状腺刺激抗体（thyroid stimulating antibody，TSAb）阳性；核素扫描显示甲状腺吸碘率弥漫性增强。所有GD患者均无其他自身免疫性疾病、肿瘤和感染性疾病等，半年内均未使用过影响免疫功能的药物；均常规测定甲状腺功能和TRAb。

1.2 试剂与仪器

异硫氰酸荧光素（FITC）标记的小鼠抗人单克隆抗体CD4（CD4-FITC）、CD8-FITC、藻红蛋白（PE）标记的CD28（CD28-PE）以及同型对照抗体IgG1-FITC、IgG1-PE（Immunotech公司，法国），溶血剂（Invitrogen公司，美国）。可溶性CD28的ELISA检测试剂盒由苏州大学医学生物技术研究所构建。流式细胞仪和离心机（Beckman Coulter公司，美国）、酶标仪（Bio-rad公司，美国）。

1.3 方法

1.3.1 GD患者外周血T细胞表面膜型CD28表达水平的分析取受试对象清晨空腹外周抗凝血2mL，以100μL/管加入流式管中，分别加入10μL/管的CD4-FITC+CD28-PE或者CD8-FITC+CD28-PE，设IgG1-FITC和IgG1-PE为同型对照，室温避光孵育20 min后加入100μL/管溶血剂，充分混匀后37℃避光孵育10min；加入预温的蒸馏水，待管中液体澄清透明后，加入3mL磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤一遍后，以0.5mL PBS重悬细胞，上机检测。

1.3.2 GD患者血清中可溶性CD28的含量测定取实验对象清晨空腹静脉血，经高速离心（4 000r/min×5min）分离血清后-20℃冷藏待检。检测前，将血清取出室温解冻后，将血清进行适量的稀释后按照苏州大学医学生物技术研究所建立的方法检测可溶性CD28的分泌[2]。

1.4 统计学方法

统计软件采用SPSS 16.0分析软件。计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，数据分布采用Kolmogorov-Smirnov检验，组间比较采用非配对t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GD患者外周血中膜型CD28分子的表达

采用免疫荧光标记和流式细胞术，检测试验组和对照组受试对象外周血不同淋巴细胞亚群及膜型CD28分子的表达。结果发现，试验组患者外周血CD4+T细胞较对照组显著减少（P＜0.05），CD4/CD8显著降低（P＜0.05），CD4+CD28+T细胞和CD8+CD28+T细胞均显著减少（P＜0.05、P＜0.01），膜型CD28分子的表达显著下降（P＜0.01）。见表1。

2.2 GD患者血清中可溶性CD28的含量

经自行建立的ELISA方法检测，试验组血清中可溶性CD28含量为（2.35±0.58）μg/L，较对照组[（0.53±0.23）μg/L]显著上调（P＜0.01）。见表2。

3 讨论

众所周知，T细胞的活化除了需要T细胞受体（TCR）-CD3和抗原肽-主要组织相容性抗原（MHC）复合物结合后提供的第一信号外，还需要多个共刺激分子对相互作用产生的第二信号。其中最重要的就是CD28-B7分子，其介导的共刺激信号是特异性细胞免疫应答所必需的。Graves′病是一种自身免疫性的甲状腺疾病，据报道，众多共刺激分子（如CD28-B7[3-4]、CD40-CD40L[5-6]、4-1BB-4-1BBL和OX40-OX40L[7]等）异常表达于GD患者外周血及甲状腺组织中，且与患者的病情严重程度、复发和预后相关。CD28分子既可以膜型形式表达于T细胞表面，又可以可溶性的形式存在于血液中。一般认为，可溶性CD28主要来源于膜型CD28胞膜外部分的脱落和信使RNA（mRNA）水平剪接和翻译后的直接分泌[8]。

表1 两组患者外周血T淋巴细胞亚群的改变及膜型CD28分子的表达（±s，%）

表1 两组患者外周血T淋巴细胞亚群的改变及膜型CD28分子的表达（±s，%）

组别例数CD4 CD8 CD4/CD8 CD28 CD4+CD28+CD8+CD28+对照组试验组P值67 105 45.600±5.720 36.200±7.942＜0.05 25.850±5.830 28.813±6.578＞0.05 1.835±0.373 1.339±0.282＜0.05 52.389±4.068 38.648±7.432＜0.01 30.786±5.143 23.367±8.562＜0.05 17.200±3.624 10.156±3.114＜0.01

表2 两组患者血清中可溶性CD28的含量比较

本研究发现，GD患者外周血中存在免疫细胞亚群的失调，无论是CD4+T细胞还是CD8+T细胞表面的膜型CD28分子的表达都显著下调。近年来的研究表明，在某些病理状态下，CD4+T细胞表面的CD28分子表达下调，即CD4+CD28-T细胞增加。体外研究表明，CD4+CD28-T细胞尽管表面丢失了CD28分子，但其在缺失共刺激信号的情况下仍然能够被功能性活化，产生大量的细胞因子，造成组织损伤。因此，该群细胞也被认为是“自身反应性T细胞”，具有特殊生物学功能，特别是在自身免疫性疾病的免疫病理机制中发挥着重要的作用。很多研究显示，自身反应性T细胞异常表达于很多自身免疫病患者外周血中，如类风湿性关节炎[9]、多发性硬化症[10]、强直性脊柱炎[11]和Wegener肉芽肿病等[12]。更有学者认为，自身反应性T细胞的异常活化很可能是GD发生的中心环节。GD患者外周血中自身反应性T细胞异常表达于Ⅲ度甲状腺肿大和合并Graves′病眼病的患者外周血中，并且其表达水平与患者的甲状腺肿大程度、浸润性突眼的发生和甲状腺自身抗体TRAb的分泌呈正相关。本研究结果提示GD患者外周血中T细胞表面膜型CD28显著减少，为GD患者外周血中自身反应性T细胞的异常增加提供了佐证。

为了分析GD患者外周血中可溶性CD28的含量，本研究用自制的可溶性CD28 ELISA检测试剂盒及检测方法对GD患者和健康者血清中的可溶性CD28的含量进行了检测。结果显示，GD患者外周血中可溶性CD28的含量较健康者显著增加，提示很有可能膜型CD28分子脱落后进入血液，导致可溶性CD28的增加。

总之，CD28作为一个重要的共刺激分子，在机体病理生理状态中都发挥着重要的作用。本研究结果显示，GD患者外周血中膜型CD28和可溶性CD28均存在异常表达，其在GD免疫病理机制中的具体生物学作用尚待进一步研究。

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The expression and their significance ofmembrane type CD28 on T cells and the production of soluble CD28 in serum from GD patients

WANG Fengming1,2 SHEN Shuang2,3 LIQiong1 LIU Tong2 SUN Jing2
1.Changzhou Center for Disease Control and Prevention,Jiangsu Province,Changzhou 213022,China;2.Institute of Medical Biotechnology,Medical College of Soochow University,Jiangsu Province,Suzhou 215007,China;3.Jiangsu Institute of Parasitic Diseases,Jiangsu Province,Wuxi 214000,China

ObjectiveTo analyze the expression ofmembrane type CD28 on T cells and the serum production of soluble CD28 in peripheral blood from GD patients,to investigate the role of CD28 molecule in the immunological pathogenesis of GD.MethodsThe peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)were collected from 105 cases of GD patients as experiment group and from 67 healthy donors as control group.The expression ofmembrane type CD28 in peripheral blood of all donors was detected by flow cytometry(FCM).The production of soluble CD28 in serum was detected using the skills of enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).ResultsThe percentage of CD4+CD28+and CD8+CD28+T cells in peripheral blood of patients from experiment group were respectively(23.367±8.562)%and(10.156±3.114)%,and were declined markedly compared with that of control group[(30.786±5.143)%and(17.200±3.624)%,respectively](P＜0.0.5,P＜0.0.1). In addition,compared with control group[(0.53±0.23)μg/L],the level of soluble CD28 was increased significantly in serum ofexperimentgroup[(2.35±0.58)μg/L](P＜0.01).ConclusionThe costimulatorymolecule CD28maybe take part in the immunological pathogenesismechanism of GD.

Membrane type CD28;Soluble CD28;Graves′disease

R581.11

A

1673-7210（2012）11（b）-0018-03

国家自然科学基金（30801023）。

王凤鸣（1978-），女，江苏常州人，医学博士，助理研究员；研究方向：共刺激分子。

2012-07-04 本文编辑：谷俊英）