安氟醚和异氟醚预处理对实验小鼠肝组织Bcl－2／Bax mRNA和蛋白表达的影响

张爱国 余 凌 王雪琳

缺血再灌注损伤（Ischemia Reperfusion Injury，IRI）指缺血后再灌注不仅不能使组织器官功能恢复，反而加重组织器官的功能障碍和结构损伤［1］。探讨IRI的特点、规律和发生机制，已成为当今医学的研究热点［2］。以异氟醚为代表的挥发性吸入麻醉剂对于许多器官的IRI具有细胞水平的多脏器保护效应，但其作用机制尚不完全清楚。细胞凋亡被认为是IRI致肝细胞死亡的主要方式，而抑凋亡因子Bcl－2和促凋亡因子Bax的表达水平在其中发挥着重要作用。本研究以异氟醚和安氟醚两种麻醉剂预处理小鼠，探讨二者对其肝组织Bcl－2和Bax表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物分组及实验药物

健康雌性C57BL／6小鼠120只，鼠龄6～8周，体重20～25g，购于中国科学院上海斯莱克实验动物中心。随机分成安氟醚吸入干预组（E组）和异氟醚吸入干预组（I组）。安氟醚和异氟醚粉剂均购于德国Sigma公司，实验时用生理盐水溶解，按Dahmani等［3］的方法配制成1.2%浓度雾化剂。

1.2 给药方法

将E组和I组小鼠分别置于自制的有进气孔和出气孔，容积大约2L的封闭舱内，恒温（36～38℃）、光照。实验前禁食12h，自由饮水。实验时E组用安氟醚雾化剂、I组用异氟醚雾化剂，使用雾化器分别向封闭舱内灌注，气流速度为5L／min。使用红外线监测仪（美国雷泰公司，型号：MX6）接出气孔检测药物含量。采用经小鼠耳缘静脉监测血氧饱和度（SpO2）和脉率（PR），使用自制面罩接红外线监测仪间断监测呼气末二氧化碳（PETCO2）及呼吸频率（RR），以确保其在实验过程中处于正常生理水平。分别于麻醉前（T0）、麻醉即刻（T1）、麻醉2h（T2）、麻醉4h（T3）、麻醉6h（T4）和麻醉终止后2h（T5），取E组和I组各10只小鼠断颈处死，并立即开腹取适量肝组织，置于液氮中保存，用于检测Bcl－2和Bax mRNA表达，另取适量肝组织于4%福尔马林溶液中固定，用以Bcl－2和Bax蛋白表达的检测。

1.3 RT－PCR 检测Bcl－2和Bax mRNA

取保存于液氮中肝组织，在液氮中研磨粉碎后，分别采用Trizol（MBI公司，芬兰）提取总RNA，逆转录试剂盒（MBI公司，芬兰）逆转录为cDNA，然后PCR扩增小鼠肝组织中Bcl－2和Bax，以GAPDH为内参照。Bcl－2引物：Forward Primer：5’－TGT TGG AGC CTA CCC CTC T－3’，Reverse Primer：5’－AAG AAG CAG CTT GAA GGA GC－3’；Bax引物：Forward Primer：5’－ACA CCT GAG CTG ACC TTG GA－3’，Reverse Primer：5’－ATG ATG GTT CTG ATC AGC TCG－3’；GAPDH 引物：Forward primer：5’－AAA TGA TAC CCC ACC GTG TGA－3’，Reverse primer：5’－TTG GTG GTG CAG GAT GCA TT－3’。以上引物均通过斯坦福大学网站引物在线设计，由上海博亚生物有限技术公司合成。反应条件：94℃ 3min；94℃ 30s，57℃30s，72℃1min，30个循环，72℃6min。扩增片段大小分别为576bp、287bp和526bp。PCR结束后，1.2%DNA凝胶电泳，全自动凝胶成像系统（Gel－Doc－It TS，美国）成像拍照，灰度扫描，采用Bcl－2或Bax电泳条带灰度值与GAPDH灰度值的比值定量分析Bcl－2和Bax表达量。

1.4 免疫组化法（SP法）测定Bcl－2和Bax蛋白含量

取适量经福尔马林溶液固定的肝组织，脱水后石蜡包埋，以4μm厚度连续切片制备白片，然后进行免疫组化染色。兔抗鼠Bcl－2和Bax单克隆抗体购自美国Abcam公司，PV－9000免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥公司。免疫组化染色按照试剂盒说明书操作。先对组织切片进行常规脱蜡、水化，然后3%H2O2去离子水孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶。EDTA（pH 8.0）修复液微波常规修复；待其自然冷却后，PBS清洗1min，滴加100μl兔抗人BMI－1（1∶100稀释），4℃孵育过夜后，PBS冲洗2min×3次；滴加试剂1，37℃孵育20min，PBS冲洗2min×3次，然后滴加试剂2，37℃孵育20～30min，PBS冲洗2min×3次。最后DAB显色10min，终止显色，苏木精复染，盐酸乙醇固定，封片并观察。以PBS作阴性对照。采用Image－Pro Plus 5.0软件（Media Cybernetics公司，美国）分析Bcl－2和Bax蛋白相对含量。

1.5 统计学处理

用SPSS 11.0统计软件对实验数据进行分析，采用χ2检验及t检验进行统计学处理。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组实验小鼠肝组织Bcl－2和Bax mRNA表达

经异氟醚和安氟醚处理后，两组小鼠肝组织中Bcl－2和Bax mRNA表达均上调，且随麻醉时间延长，表达逐渐增加，麻醉终止后2h表达均下调（图1A）。定量分析结果显示，相对于T0，T2～T5的Bcl－2和Bax mRNA表达均上调（P＜0.05或P＜0.01），以T4最为明显（P＜0.01），而各组T1与T0比较Bcl－2mRNA表达有所降低，但无统计学意义（P＞0.05）（图1B）。

2.2 Bcl－2和Bax蛋白在两组小鼠肝组织中的表达

图1 两组小鼠肝组织Bcl－2和Bax mRNA表达（n均＝10）

Bcl－2和Bax蛋白SP法阳性染色均为棕黄色，可表达于肝细胞胞浆和胞核中。两组实验小鼠肝细胞在T0～T2时不着色或仅见少量胞浆呈阳性染色，T3时两组肝细胞胞浆均可见阳性染色，胞核也呈阳性染色；T4～T5时两组肝细胞均见大量胞核染色阳性。定量分析表明，两组在T2～T5时肝组织Bcl－2蛋白含量较T0增加（P＜0.05或P＜0.01），而Bax蛋白含量在T3～T5时较T0时增加（P＜0.05或P＜0.01）。两组Bcl－2和Bax蛋白在T1时表达均较T0时有所下调。与T0时比较，两组Bcl－2／Bax蛋白比值均明显升高（P＜0.05），以I组升高较为明显。见表1。

表1 两组小鼠肝组织中Bcl－2和Bax蛋白表达的变化（s，n均＝10）

表1 两组小鼠肝组织中Bcl－2和Bax蛋白表达的变化（s，n均＝10）

注：与 T0比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01

I组 0.318±0.014 0.324±0.016 0.486±0.0171） 0.426±0.032 0.516±0.0392） 0.432±0.0422）Bax E组 0.357±0.011 0.193±0.009 0.375±0.021 0.566±0.0632） 0.643±0.0512） 0.484±0.0372）I组 0.303±0.010 0.206±0.009 0.343±0.015 0.347±0.0121） 0.414±0.0321） 0.343±0.0211）Bcl－2／Bax E组 1.02±0.57 1.42±0.381） 1.16±0.241） 1.12±0.351） 1.06±0.37 1.08±0.13 I组 1.05±0.61 1.57±0.431） 1.42±0.311） 1.23±0.431） 1.26±0.431） 1.26±0.281）T0 T1 T2 T3 T4 T5 Bcl－2 E组 0.364±0.012 0.274±0.013 0.435±0.0121） 0.634±0.0432） 0.683±0.0642） 0.522±0.0342）蛋白 组别

3 讨 论

越来越多的研究表明，以异氟醚为代表的挥发性吸入麻醉药对机体具有不同程度的保护作用，其作用机制也已经部分地揭示出来。Dahmani等［3］研究发现给予适量异氟醚，能导致大鼠脂质过氧化作用一过性和可逆性增强；脂质过氧化反应增强时，过剩的自由基可刺激SOD代偿性升高，有效防护组织细胞损伤［4，5］。Bcl－2基因的表达主要位于线粒体、细胞核及内质网的膜上，能抑制线粒体通透性变化及线粒体凋亡诱导因子和细胞色素C的释放，Bcl－2过表达时能完全抑制脂质过氧化，从而起到抑制细胞凋亡的作用［6，7］。

本研究对实验小鼠吸入麻醉剂后的肝组织研究结果表明，安氟醚和异氟醚吸入2h后Bcl－2mRNA转录增加，6h后达高峰，麻醉终止后2h开始恢复，同时也发现随着麻醉时间的延长，促凋亡基因Bax mRNA表达也逐渐增加，进一步在蛋白水平分析也发现了类似的结果，因此推论，安氟醚和异氟醚对肝组织的保护可能主要通过上调Bcl－2表达发挥作用。此外，本研究还发现两组在T1时相肝组织Bcl－2表达降低，这种暂时性降低可能与麻醉早期的免疫抑制有关，也与Jang等［8］报道的安氟醚及异氟醚对T淋巴细胞的抑制是有选择性的，而且是暂时的观察结果相一致。Boost等［9］研究发现吸入不同麻醉剂对蛋白合成的影响不同，而本实验中T3～T5时相的E组Bcl－2和Bax蛋白表达高于I组Bcl－2和Bax蛋白表达的结果验证了上述观点。

综上所述，吸入麻醉剂安氟醚、异氟醚可以使肝组织中Bcl－2和Bax mRNA表达和蛋白含量增加，其中又以异氟醚所致Bcl－2／Bax比值较高，即异氟醚可能通过抑制肝细胞凋亡而有益于肝组织自我保护功能。尽管其机制尚未完全清楚，但本实验结果可以为临床麻醉剂的选择应用提供帮助。

1 Lemasters JJ，Theruvath TP，Zhong Z，et al.Mitochondrial calcium and the permeability transition in cell death［J］.Biochim Biophys Acta，2009，1787（11）：1 395～1 401.

2 Gourdin MJ，Bree B，De Kock M.The impact of ischaemiareperfusion on the blood vessel［J］.Eur J Anaesthesiol，2009，26（7）：537～547.

3 Dahmani S，Stany I，Brasher C，et al.Pharmacological prevention of sevoflurane－and desflurane－related emergence agitation in children：a meta－analysis of published studies［J］.Br J Anaesth，2010，104（2）：216～223.

4 Sethu MJ，Puri GD，Mathew PJ.Closed－loop isoflurane administration with bispectral index in open heart surgery：Randomized controlled trial with manual control［J］.Acta Anaesthesiol Taiwan，2011，49（4）：130～135.

5 Liu Shanlin，Shi Dongyun.Oxygen free radicals in rats and rabbits compensatory effect observed［J］.Acta Universitatis Medicinalis Secondae Shanghai，1996，16（3）：201～204.

6 Bazan NG.Lipid signaling in neural plasticity，brain repair，and neuroprotection［J］.Mol Neurobiol，2005，32（1）：89～103.

7 严志康，肖 端，龚梅芳.大黄对大鼠脑缺血－再灌注损伤Bcl－2、bax表达的影响［J］.微循环学杂志，2008，18（2）：22～24.

8 Jang HR，Gandolfo MT，Ko GJ，et al.B cells limit repair after ischemic acute kidney injury［J］.J Am Soc Nephrol，2010，21（4）：654～665.

9 Boost KA，Leipold T，Scheiermann P，et al.Sevoflurane and isoflurane decrease TNF－alpha－induced gene expression in human monocytic THP－1cells：potential role of intracellular IkappaBalpha regulation［J］.Int J Mol Med，2009，23（5）：665～671.