人脐血内皮祖细胞的体外培养

王明勇 李 燕 宋淑敏 彭 强▲

1.泸州医学院附属医院医学实验中心，四川泸州 646000；2.泸州医学院附属医院小儿外科，四川泸州 646000

人脐血内皮祖细胞的体外培养

王明勇1李 燕1宋淑敏2彭 强2▲

1.泸州医学院附属医院医学实验中心，四川泸州 646000；2.泸州医学院附属医院小儿外科，四川泸州 646000

目的 从人脐带血中分离内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs），建立人脐血内皮祖细胞体外培养的方法，为实现内皮祖细胞的移植及实验研究提供足量的细胞来源。 方法 采用密度梯度离心法分离人脐带血内皮祖细胞，在EGM-2培养基中培养，采用流式细胞仪、免疫组化和免疫荧光鉴定EPCs。 结果 脐带血单个核细胞在经EGM-2培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态；1周后既分化成EPCs，细胞免疫荧光CD133染色率在培养第7天为（67.2±2.12）%，免疫组化CD34染色率为（89.67±2.05）%，流式细胞仪鉴定该种细胞CD133与KDR的双阳性率达87.8%。可确定该细胞为EPSc。 结论 采用本培养方法可获得良好的内皮祖细胞用于实验研究。

细胞培养技术；单个核细胞；人脐血；内皮祖细胞

自1997年Asahara等[1]首次在成人外周血分离到循环内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）以来，此后又陆续在骨髓、脐带血和其他软体组织中发现EPCs[2]。内皮祖细胞是来源于骨髓、外周血及脐带血和其他软体组织在外周血中循环，并能增殖分化为成熟的内皮细胞的一类前体细胞[3]。从脐带血中分离获取EPCs进行体外培养，较从骨髓、外周血和其他软体组织获取EPCs的量更多，损伤和风险更小，虽然从外周血中分离EPCs也很方便，但其含量仅为从脐带血中分离EPCs量的十分之一[4-7]。本实验通过密度梯度离心得到单个核细胞后，通过添加一些细胞因子进行体外培养，从而诱导和促进EPCs的分化，以获得足够的EPCs用于实验研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人淋巴细胞分离液（Ficoll-Hv-qapue，密度1.077 g/mL，天津市灏洋生物制品有限公司）；EGM-2培养基 （Lonza，美国）；胎牛血清（Hyclone，美国）；血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF）和胰岛素样生长因子（IGF-1）均为美国Peprotech公司产品；纤维连接蛋白（FN，Sigma，美国）；兔抗人 CD133 单克隆抗体（Santacruz，美国）；鼠抗人CD34（epitomics，美国）；FITC标记鼠抗人单克隆血管内皮因子受体-2（VEGFR-2）（KDR）抗体，PCY 标记鼠抗人CD133（Becman Coulter，美国）。X-60倒置相差显微镜（Nikon，日本）；AX70 荧光显微镜及图像采集仪（Olympus，日本）；流式细胞仪（Becman Coulter，美国）。

1.2 方法

1.2.1 脐血内皮祖细胞的分离 无菌条件下取正常剖宫产胎盘中的脐带血50 mL（均签署知情同意书并获我院伦理委员会同意）。脐血中加入肝素（20 U/mL）抗凝，室温静置30～60 min。尽量吸取上清液到含有5 mL PBS缓冲液的试管中混匀；每个10 mL管中加入淋巴细胞分离液2 mL，然后加入混匀的脐血上清液4 mL；将试管放入水平离心机，2 000 r/min离心20 min；吸取呈乳白色的第2层细胞（单核细胞层）加入到含4 mL PBS液中混匀，1 200 r/min离心10 min；弃上清液，加入3 mL PBS液，混匀沉淀，1 000 r/min离心5 min；弃上清液，加入适量的培养基 （EGM-2+20%胎牛血清+50 ng/mL VEGF+20 ng/mL bFG F+20 ng/mL IGF-1）吹打混匀。

1.2.2 脐血内皮祖细胞的培养 分离的单核细胞以1×105/cm2接种于纤维连接蛋白包被的12.5 mL培养瓶中；37℃、5%CO2、饱和湿度中培养；第3天半量换液，此后每2～3 d全量换液1次。

1.2.3 血管内皮祖细胞的鉴定 ①形态学观察：前2 d静置培养细胞，从第3天开始观察。②免疫细胞化学染色：用0.02%EDTA消化培养7 d细胞，制成细胞涂片，采用SABC法，对细胞涂片的CD34进行免疫细胞化学染色，DAB显色，PBS液代替一抗作阴性对照，以细胞质出现棕黄色颗粒为CD34阳性细胞。③免疫荧光染色：用0.02%EDTA消化培养7 d细胞，制成细胞涂片，细胞经4%多聚甲醛固定，10%BSA封闭后，加入兔抗人CD133单克隆抗体（1∶100），阴性对照只加血清，37℃孵育60 min，PBS洗涤，加入FITC标记的荧光素二抗（1∶50），37℃孵育 30 min，PBS 洗涤，干燥，封片，荧光显微镜观察，显示绿色荧光的细胞为CD133阳性细胞。④流式细胞检测：用0.02%EDTA消化培养7 d细胞，制成1×106/L细胞悬液，分别加入FITC标记鼠抗人单克隆血管内皮因子受体-2（VEGFR-2）（KDR）抗体，PCY 标记鼠抗人 CD133 抗体各20 μL避光室温反应30 min，然后上机检测，分析KDR和CD133共表达情况。

2 结果

2.1 细胞形态学观察

在培养第3天可见约40%贴壁细胞为梭型；第4～5天贴壁细胞出现细胞集落，周围细胞以集落为中心，呈发芽式向外生长，周围为呈放射状分布的梭形细胞（图1）；8～10 d出现“铺路石样”形似鹅卵石的单层细胞（图2）。

2.2 免疫细胞化学染色

CD34免疫组化染色显示（89.67±2.05）%培养7 d细胞为阳性。

2.3 免疫荧光染色

CD133免疫荧光染色显示（67.2±2.12）%培养7 d细胞为阳性。

2.4 流式细胞检测

流式细胞分析培养7 d细胞KDR和CD133的表达率共达87.8%。

3 讨论

有研究认为血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞因子（bFGF）、胰岛素样生长因子（IGF-1）、表皮生长因子（EGF）对内皮祖细胞有调控作用，能促进内皮祖细胞的体外生长[8-9]。这些生长因子用于培养内皮祖细胞的使用剂量和使用的种类，各个实验室各不相同，本实验采用3种生长因子进行体外内皮祖细胞的培养：VEGF使用浓度为50 ng/mL，bFGF为 20 ng/mL，IGF-1为 20 ng/mL。

体外分离内皮祖细胞的方法主要有免疫磁珠、流式细胞术和密度梯度离心法，前两种虽然可获得高纯度的细胞，但其回收内皮祖细胞的量少且操作复杂，费用昂贵。通过预试验我们对采取经过静置30～60 min的抗凝脐血上清液 （血浆）和采用抗凝脐血与PBS缓冲液1∶1稀释后的血液分别用密度梯度离心法获得的单个核细胞通过显微镜观察比较，发现用静置脐血血浆分离获得的单个核细胞中的红细胞含量远远少于用PBS缓冲液与脐血 1∶1稀释后的血液分离获得的单个核细胞中的红细胞含量，且用静置脐血血浆分离获得的单个核细胞进行内皮祖细胞培养发现细胞贴壁情况比用PBS缓冲液与脐血 1∶1稀释后的血液分离获得的单个核细胞进行内皮祖细胞培养的贴壁情况要好。因此，本实验采用密度梯度离心法从静置30～60 min的抗凝脐血上清液 （血浆）中获得单个核细胞用于内皮祖细胞的体外培养。

内皮祖细胞的培养方法主要有：一种方法是将获得的单个核细胞接种到预先铺有纤维连接蛋白的培养板中，24 h后将未贴壁的细胞重新接种到新的铺有纤维连接蛋白的培养板中继续培养[1]；另一种方法是将单个核细胞接种到培养板中，培养4 d后弃掉未贴壁的细胞，留下的贴壁细胞继续培养[10]；还有一种是把单个核细胞接种到铺有Ⅰ型胶原的培养板中，然后弃掉未贴壁的细胞，贴壁细胞继续培养[11]。纤维连接蛋白可促进细胞的黏附，并且与VEGF协同可提高内皮祖细胞的迁移和分化[12]，因此本实验采用的内皮祖细胞培养方法是将获得的单个核细胞接种到铺有纤维连接蛋白的培养瓶中，静置培养3 d后弃去未贴壁的细胞，贴壁细胞继续培养。

内皮祖细胞的的鉴定观点不一。有人把表达CD34和KDR 的认为 EPCs[1]；有些学者认为 CD34、CD133、KDR 是EPCs特征性标志[13]；也有学者把EPCs分为两类，早期EPCs（CD34+、CD133+、KDR+），晚期 EPCs（CD34+、CD133－、KDR+）[14-16]。

通过对本实验培养的内皮祖细胞鉴定发现：细胞免疫荧光CD133染色率在培养第7天为 （67.2±2.12）%，免疫组化CD34染色率在培养第7天为（89.67±2.05）%，流式细胞仪鉴定该种细胞在培养第7天CD133与KDR的双阳性率达87.8%。可确定为EPCs，采用本方法可获得良好的内皮祖细胞用于实验研究。

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Cultivation in vitro of people umbilical cord blood endothelial progenitor cells

WAMG Mingyong1LI Yan1SONG Shumin2PENG Qiang2▲
1.Medical Experiment Center,the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College,Sichuan Province,Luzhou 646000,China;2.Department of Pediatric Surgery,the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College,Sichuan Province,Luzhou 646000,China

Objective To establish a method of endothelial progenitor cells isolated from human umbilical cord blood in vitro,and to provide a sufficient amount of source for endothelial progenitor cell transplantation and experimental study.Methods Isolate from human umbilical cord blood endothelial progenitor cells with density gradient centrifugation,and culture in EGM-2 medium.EPCs were identificatd by flow cytometry and immunofluorescence.Results The cells cultured in EGM-2 were displayed spindle-shaped and cobble-stone morphology,and differentiated into EPCs a week later.The rate of CD133 immunofluorescence staining was(67.2±2.12)%on seven days.The rate of CD34 Immunohistochemical staining was(89.67±2.05)%on seven days.The double positive rate of CD133 and KDR was 87.8%in these cells.It could determine that the cell was EPSc.Conclusion We can obtain available endothelial progenitor cells using this culture method for experimental research.

Cell culture technology;Mononuclear cells;Human umbilical cord blood;Endothelial progenitor cells

R329.23

C

1673-7210（2012）05（a）-0032-03

国家自然科学基金资助项目（30700876）；四川省教育厅资助项目（2006B026）。

▲通讯作者

2012-02-20 本文编辑：冯 婕）