产锰过氧化物酶细菌的筛选及其对孔雀石绿脱色的研究

杨 晔， 李国辉， 高剑平， 丁重阳*， 顾正华， 张 梁， 石贵阳

（1.江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡 214122；2.漳州职业技术学院，福建 漳州363000）

木质素降解酶主要有3种：木质素过氧化物酶（Lignin peroxidases/Lip）、锰过氧化物酶（Manganese peroxidases/Mnp）和漆酶（Laccase/Lac），这些氧化酶对多种污染物都表现出了广谱的降解作用，包括酚类、多环芳烃、多种染料、五氯联苯等难降解物质[1]，其中Lip与Mnp合成后分泌到胞外 ，经H2O2启动一系列自由基链反应 ，依靠氧化还原反应降解各种结构的染料[2]，具有重要的应用价值。据报道，白腐真菌拥有强大的木质素降解酶系统[3]，但真菌的在极端环境和底层环境中，如高pH值，缺氧，高渗透压以及木质素浓聚物中的稳定性较差；而细菌具有来源广泛、生长快速，适应能力强，易于改造及大规模应用等优势，且在木质素的降解过程中，需要多菌种协同作用[4]，因此细菌产木质素降解酶的研究显示出诱人的前景和广阔的发展空间。目前，对于细菌产木质素降解酶的研究，主要以木质素过氧化物酶（Lip）为主[5-6]，鲜有关于细菌产锰过氧化物酶的研究报道。

作者从采自江苏省无锡市多个木材厂的腐木及腐殖土的表层土样等12份样品中筛选得到一株高产锰过氧化物酶活力的菌株，并对其在孔雀石绿染料降解与脱色上的应用进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 菌种来源

从无锡某木材厂中采集到的腐木及腐殖土的表层土样等12份样品。

1.2 培养基

无 机 培 养 基 （g/L）：K2HPO41；NaH2PO41，（NH4）2SO40.5；MgSO40.2；CaCl20.1；FeSO40.05；MnSO40.02；木屑 10；pH 值 7.0；LB 培养基（g/L）：氯化钠5，酵母膏5，蛋白胨10，pH值自然；苯胺蓝脱色培养基[7]：每1 000 mL LB培养基中加入0.1 g苯胺蓝，避光；染料脱色培养基（g/L）：LB培基中加入一定量的染料构成染料脱色培养基。

1.3 试剂及仪器

主要试剂：孔雀石绿；磷酸氢二钾，磷酸二氢钠，硫酸铵，硫酸镁，氯化钙，硫酸亚铁，硫酸锰：分析纯，均为国药集团化学试剂有限公司生产。

主要仪器：U-3000紫外分光光度计：日立公司产品；MK3酶标仪：上海科学仪器有限公司产品。

1.4 方法

1.4.1 产木质素降解酶菌株筛选 称取10 g腐殖土，加入含有90 mL无菌水的锥形瓶中，置于摇床150 r/min振荡20 min，取10 mL上述溶液接种于无机培养基（50 mL/250 mL），30℃、150 r/min富集培养7 d后，取富集液适当稀释涂布苯胺蓝脱色培养基，30℃避光培养，选取透明圈产生快速、明显的菌落接种50 mL LB培养基，24 h后转接相同新鲜LB培养基，30℃、120 r/min振荡培养。定时取样测定酶活力，选取产酶活力高的菌株经多次复筛纯化后保藏待用。

1.4.2 酶活力的测定 Mnp酶活力的测定按文献[8]的方法进行，Lip酶活力的测定按文献[9]提供的方法进行，按文献[10]提供的方法进行Lac酶活力的测定。

1.4.3 菌 种 鉴 定 参 照 《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology （Vol.Ⅳ ）》对菌株 J09 进行生理生化鉴定。通过Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction和DNA自动测序仪 （美国Applied Biosystems公司，型号 ABI 3130）测定 16S rDNA序列，并通过16S rDNA进行同源性序列比较及进化树分析对菌株J09进行菌种鉴定。

1.4.4 菌种对染料的脱色 染料最大吸收波长的测定：使用分光光度计对含一定量染料的空白发酵液在200～900 nm进行全波长扫描，确定其最大吸收波长。

发酵液对染料的脱色：培养至酶活力最高时加入一定浓度染料，30℃，150 r/min继续培养，每隔3 h取样，离心取上清液，在最大吸收波长下检测染料吸光值的变化。

粗酶液对染料的脱色：培养至酶活力最高时，离心除去菌体，得粗酶液，100 mL锥形瓶中加50 mL粗酶液和一定浓度的染料，定时取样，检测染料吸光值的变化，至吸光值不变。

生物量的测定：测定所取培养基样品在620 nm下的吸光度，以不接菌的空白培养基为对照；脱色率的测定：加入染料后混匀，在染料的最大吸收波长下测定上清液初始吸光值A0，定时取样，测定上清液吸光值 A1。 染料脱色率=（（A0-A1）/A0）×100%

2 结果与讨论

2.1 产锰过氧化物酶细菌的筛选

初筛获得具有产锰过氧化物酶能力的菌株70株，在进一步复筛获得6株菌株的基础上筛选得到1株具有高产锰过氧化物酶能力的菌株J09。在优化的条件下，该菌株发酵3 d锰过氧化物酶活力达到最大，为607.7 U/L。

2.2 产锰过氧化物酶细菌的鉴定

参 照 《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology（Vol.Ⅳ ）》对菌株J09进行生理生化鉴定。生理生化特征与草木犀中华根瘤菌相吻合，结果见表1。

表1 菌株J09的生理生化特征Tab.1 Conventional tests for identification of J09

利用PCR技术和DNA测序技术对得到的菌株进行16S rDNA扩增测序，将测序结果与GeneBank中已知的16S rDNA序列进行同源性比较，构建系统发育树，最终确定菌株的进化分类地位。结果如图1显示，菌株J09与草木犀中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）同源性达到99%，命名为草木樨中华根瘤菌J09（Sinorhizobium meliloti J09）。该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2011318。

图1 基于16s RNA序列同源性的J09系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of J09 based on 16s RNA sequences

2.3 Sinorhizobium meliloti J09对染料的脱色

2.3.1 脱色光谱分析 在LB培养基中添加孔雀石绿至终质量浓度为15 mg/L，由图2可见，孔雀石绿的最大吸收波长在617 nm。经过发酵液和粗酶液脱色后，此处的吸收峰均明显降低，且经发酵液脱色后的吸光值降低幅度较大，表明该菌株所产酶对孔雀石绿有明显的脱色作用，且其菌体对孔雀石绿也具有一定的吸附作用。

图2 孔雀石绿及脱色处理后的紫外—可见光谱Fig.2 Visible spectrumof malachite green

图3 孔雀石绿脱色率随时间变化曲线Fig.3 Decolorization rate of malachite green at different times

2.3.2 发酵液及粗酶液对孔雀石绿染料的脱色由图3可知，发酵液与粗酶液对孔雀石绿均表现出显著的脱色效果。脱色处理3 h时，发酵培养液对染料的脱色率已经达到89.8%，粗酶液对染料的脱色率达到78.5%；3 h后，随时间的延长，脱色率增长缓慢，推测其原因为菌体对染料的吸附能力已基本饱和且粗酶液酶活降低。

在Mnp酶活为607.7 U/L的粗酶液中加入孔雀石绿后并没有立即表现出脱色效果，而含有菌体的发酵液在加入孔雀石绿后，随即表现出42%的脱色率，表明菌体细胞对孔雀石绿有一定的吸附作用。发酵液的脱色效果是菌体吸附与酶降解共同作用的结果，因而优于粗酶液，这与光谱分析的结果一致。

2.3.3 氧气对培养液脱色效果的影响 由图4可见，在振荡培养的条件下的脱色率均高于静置培养条件下的脱色率，表明该菌在氧气充足的条件下脱色效果更好。草木犀中华根瘤菌是好氧细菌，充足的溶氧更利于菌体生长和酶的合成，因此对染料有更好的脱色效果。

图4 不同培养条件下孔雀石绿脱色率随时间变化曲线Fig.4 Decolorization rate of malachite greenat different times on different conditions

2.3.4 染料对菌体生长的影响 为探究染料对菌体生长的影响，菌体培养72 h时，向发酵液中加入15 mg/L的孔雀石绿。加入染料后，由于染料的特征吸收峰617 nm与细胞吸收峰620 nm相近，使得细胞表象吸光值增高。随着染料的不断降解，在以后的整个细菌生长过程中，染料组的细胞生物量均低于对照。结果表明三苯甲烷类染料孔雀石绿加速了细胞衰亡，对菌体生长有一定的不利影响。

3 结语

从无锡某木材厂中采集到的腐木及腐殖土的表层土样分离到一株高产锰过氧化物酶的细菌J09，经鉴定为草木犀中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）。该菌发酵所得的发酵液及粗酶液对孔雀石绿均有显著的脱色效果，在酶活达到最高时，分别在发酵液和粗酶液中加入15 mg/L的孔雀石绿，在振荡培养3 h后，其脱色率分别达到89.8%和78.5%；充足的氧气利于该菌株脱色效率的提高；同时，研究表明孔雀石绿对该菌体生长有不利影响。

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