RP-HPLC测定健脾益肾颗粒中齐墩果酸的含量

李 胜 涂文升 邓秋丽

（广西肿瘤防治研究所药剂科，广西 南宁 530021）

健脾益肾颗粒由党参、枸杞子、女贞子、白术、菟丝子、补骨脂（盐灸）等中药经提取加工而成的颗粒剂。具有健脾益肾的功效，用于减轻肿瘤病人术后放、化疗副反应，提高机体免疫功能以及脾肾虚弱所引起的疾病。据文献报道[1]：健脾益肾颗粒能有效地减轻肿瘤患者化疗的毒副作用，提高患者的免疫功能；临床研究表明健脾益肾颗粒能预防化疗后白细胞减少[2]；对肿瘤患者化疗中或化疗后的脾肾两虚症具有明显的疗效[3]。对肺癌化疗相关性贫血有一定治疗作用[4]。健脾益肾颗粒可改善脾肾阳虚型慢性肾炎患者的临床症状、体征及炎症介质鸟IL-6的水平，疗效优于肾炎四味片[5]。对慢性乙型病毒性肝炎患者的治疗显示其具有免疫细胞增生作用，肝功能恢复良好，具有较强护肝、抗炎作用，是临床疗效较好的护肝药，同时具有促进慢性乙型病毒性肝炎患者免疫功能的作用[6]。未检索到有测定健脾益肾颗粒含量的文献报道。在参考有关文献[7]的基础上，建立了反相高效液相色谱法测定健脾益肾颗粒中齐墩果酸含量的方法，本法准确、简便、快速，可作为健脾益肾颗粒的质量控制指标。

1 仪器与试剂

岛津LC-10AVP高效液相色谱仪、SPD-10AVP紫外外-可见检测器、WML-2010（色谱工作站）；甲醇（高效液相色谱淋洗剂，上海国药集团化学试剂有限公司）、磷酸为分析纯，双蒸水（自制）。

齐墩果酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：0709-9808）；健脾益肾颗粒为北京XX制药厂产品（批号：10010103、10010306、10010320）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Platisil ODS柱（4.6mm×250mm，5μm），以甲醇-水-冰醋酸（30∶63∶3），流速1.0mL/min；检测波长210nm，柱温40℃。结果见图1。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取齐墩果酸对照品10.5mg，置50mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（0.21mg/L）。

2.3 供试品溶液的制备

取健脾益肾颗粒适量，研磨，精密取健脾益肾颗粒粉末2.00g，置具塞三角烧瓶中，加入流动相20.0mL，摇匀，称重，超声提取40min，取出，放至室温，再称定重量，用流动相补足减失的质量，滤纸过滤，取续滤液1.0mL，离心15min（15 000r/min），上清液即为供试品溶液。

2.4 空白试验

取除去女贞子以外的其他4味药材，按样品制备方法制成阴性溶液。精密吸取供试品溶液、阴性溶液各15.0μL，对照品溶液10.0μL，注入液相色谱仪中，绘制液相色谱图，由色谱图看出，在对照品色谱图相应的位置上，供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰，阴性溶液在此峰位无吸收，对本品中齐墩果酸的含量测定无干扰，方法专属性良好。见图1。

2.5 标准曲线考察

精密吸取齐墩果酸对照品溶液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5μL，分别注入高效液相色谱仪，测定峰面积，以对照品进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程Y=4.8×105+7.5×103X，r=0.999 9，结果表明，齐墩果酸在0.525～3.675μg的线性范围线性关系良好，测得最低检出限为0.525μg。

2.6 精密度试验

精密吸取供试品溶液，连续进样6次，测定峰面积。结果齐墩果酸峰面积RSD为1.67%。

2.7 稳定性试验

1.标准品HPLC色谱图

2. 样品HPLC色谱图

3.齐墩果酸线性关系图

4. 缺柚皮苷的HPLC色谱图

取供试品溶液室温放置，分别于制备后0、4、8、12、24、48h 进行测定，结果齐墩果酸峰面积RSD为1.15%。表明齐墩果酸在48 h 内基本稳定。

2.8 重复性试验

精密量取同一样品6份，按“2.3”项下操作，制成供使品溶液，进行测定，齐墩果酸含量RSD为1.70%。

2.9 加样回收率试验

分别精密取2.0已知含量的健脾益肾颗粒粉末，加入适量的标准品准液，按2.3方法制成供试品溶液，进行测定，计算回收率，结果见表1。

2.10 样品含量测定

分别精密取不同批号的健脾益肾颗粒粉末共9份（每一批号3份），按“2.3”项下制备，各取15.0μL，注入液相色谱仪，测定，即得。含量测定结果见表2。

3 讨 论

健脾益肾颗粒是以中药经科学组方，现代工艺制备的颗粒型制剂。具有保肝、护肝、提高患者抵抗力及减轻恶性肿瘤患者因放、化疗引起的毒副作用等[1-7]。但利用多种搜索引擎及维普数据库均没有发现该制剂的质量控制方法。本文在参考相关文献的基础上，建立简便、快速、可靠的用RP-HPLC法测定该制剂中齐墩果酸的含量作为其质量控制指标。

该方法取健脾益肾颗粒，研磨，精密称取2.0g，置于具塞三角烧瓶中，加入20.0mL流动相，密塞，称重，置于CQ-80超声波清洗机（上海跃进医用光学器械厂），超声提取40min，放至室温，称重，用流动相补足减失的质量，滤纸过滤，取续滤液1.0mL，离心15min（15 000r/min），上清液即可进样测定，齐墩果酸的理论塔板数均在1 1000以上，分离度均＞1.5。完全达到药典的一般药物分析的要求。

经上述HPLC条件及方法的测定，健脾益肾颗粒每克含齐墩果酸在40.4087～42.4021mg范围之间，按药典规定每克健脾益肾颗粒含齐墩果酸应不低于38.3883mg。

笔者曾用健脾益肾颗粒，分别加入甲醇、甲醇-水超声提取30min；还用加热回流3h，经测定无齐墩果酸保留峰。还用甲醇-水溶解，三氯甲烷提取3次，合并三氯甲烷提取液，水浴挥干，用5mL甲醇溶解并转移至5mL的量瓶中，取1.0mL，离心10min（15000r/min），注入高效液相色谱仪中测定，分离效果也较好，但经过对比，齐墩果酸的含量较少，即提取不完全，没有本法的效果好。

[1]董海涛,刘浩,关念波,等.健脾益肾颗粒减轻528例肿瘤患者化疗毒副作用的临床观察[J].中国中医药信息杂志,2008,15(9):12-13.

[2]彭轶霞,张亚密,潘改燕.健脾益肾颗粒预防化疗后白细胞减少症的临床研究[J].湖北中医杂志,2009,31(5):29-30.

[3]江玲,邓晓玲,江洪.健脾益肾颗粒治疗恶性肿瘤化疗副反应观察[J].实用中医药杂志,2006,22(4):234-235.

[4]刘杰,侯丽,陈信义.健脾益肾颗粒治疗肺癌相关性贫血的临床研究[J].中医药学刊,2006:24(2):277-278.

[5]田彬,范伏元.健脾益肾颗粒剂对脾肾阳虚型慢性肾炎患者尿IL-6水平的影响[J].湖南中医药大学学报,2008,28(4):50-52.

[6]崔爱玲、范天利.健脾益肾颗粒对慢性乙型病毒性肝炎患者T淋巴细胞亚群的影响[J].中国药业,2008,17(15):22-23.

[7]王林凤,杨红侠.HPLC法测定潮安颗粒中齐墩果酸的含量[J].现代中医药,2007,27(2):64-65.