热痹康汤对胶原诱导性关节炎大鼠血清IL-1β及IL-4的影响*

★ 刘欢 庞学丰 吴燕红 唐丽萍 龙朝阳 潘燕 王乾 (广西中医学院附属瑞康医院 南宁530011)

类风湿关节炎(Rheumatiod Arthritis，RA)是一种以侵犯外周关节为主的自身免疫性疾病，以关节滑膜的慢性炎症为主要表现，其发病可能是一种受抗原驱动的“激发-链锁反应”的过程，感染和自身免疫反应是类风湿关节炎发病和病情迁延的中心环节［1］。虽然目前对RA的病因学还不是十分清楚，但活动期的RA患者血清中IL-1β水平增高，IL-4水平降低，提示IL-1β、IL-4在RA的发病过程中起着重要的作用。本研究采用牛Ⅱ型胶原蛋白(typeⅡCollagen，CⅡ)诱导大鼠关节炎模型(Collagen induced arthritic rats，CIA)，观察热痹康汤对大鼠血清IL-1β、IL-4的调节作用，探讨热痹康汤治疗类风湿关节炎的作用机理。

1 材料与药物

1.1 材料

60只Wistar大鼠，清洁级，动物合格证号:桂医动字第17014号。体重100±10g，雌性，购于广西中医学院实验动物中心;牛II型胶原蛋白、弗氏不完全佐剂购于Chondrex(美国)公司;IL-1β、IL-4试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.2 实验药物

甲氨蝶呤(MTX)为上海医药(集团)有限公司信谊制药总厂产品。热痹康汤(组成:秦艽15 g、防风 10 g、桂枝10 g、威灵仙10 g、制川乌10 g、地龙10 g、桑枝 15 g、葛根 15 g、忍冬藤 15 g、青风藤 15 g、黄柏20 g、苍术15 g)，制备后浓度为每毫升汤剂含生药0.8 g，由广西中医学院附属瑞康医院制剂室制备提供。

2 方法

2.1 实验动物造模及分组

60只大鼠适应性喂养7天后，随机选取10只为正常对照组，其余50只参照文献［2］方法造模。在无菌条件下，用0.1 mol/L冰醋酸充分溶解牛II型胶原蛋白，浓度为4 mg/L，置4℃冰箱过夜后，再与等体积弗氏不完全佐剂(1 mg/mL)混合、震荡至充分乳化，制成C II乳剂，置4℃冰箱保存备用。试验时于每只大鼠颈、背部多点皮内注射0.25 ml致炎，于14 d后按上述方法和剂量再次免疫。根据大鼠关节炎临床指征评分，确定免疫成功后(5分或以上)随机分为5组:①模型组10只;②甲氨蝶呤组10只;③热痹康汤高剂量组10只;④热痹康汤中剂量组10只。⑤热痹康汤低剂量组10只。

2.2 给药方法

正常对照组，自由饮水;模型组以生理盐水2 ml/100g灌胃，每日1次;甲氨蝶呤组灌服甲氨蝶呤药液1 mg/kg(为60kg成人临床用药量换算得出)，每只灌服约0.1 mg，每周灌服1次;热痹康汤高、中、低剂量组(高、低剂量组用药剂量分别为正常组用药剂量的2倍、0.5倍)，分别以热痹康汤(含生药1.6、0.8、0.4 g/ml)2 ml/100g，每日分 2 次灌胃。

3 检测项目及方法

3.1 关节肿胀指数

参照文献［3］采用0－4级关节评分法。0分:无关节炎;1分:小趾关节轻度肿胀;2分:小趾关节和足跖肿胀;3分:踝关节以下的足爪肿胀;4分:包括踝关节在内全部关节肿胀;关节指数积分越高，关节症状越严重。给药前、治疗后1周、2周、4周各观察1次，并做好记录。

3.2 IL-1β 及IL-4的检测

造模成功后分组给药，治疗28d后，将各组大鼠麻醉，腹主股动脉抽血，分离血清，－20℃保存待测。IL-1β、IL-4的测定采用ELISA试剂盒，并按试剂盒说明进行检测。

3.3 统计学处理

4 结果

4.1 关节肿胀指数观察

治疗第2周时，各组指数低于模型组，其中甲氨蝶呤、热痹康汤高、中剂量组与模型组有显著性差异(P＜0.05)。治疗第4周时，各组指数低于模型组，与模型组均有显著性差异(P＜0.05)。结果见表1。

表1 各组关节肿胀指数(±s)

表1 各组关节肿胀指数(±s)

注:与模型组比较，*P ＜0.05。

组别 n 给药前 治疗后1周 治疗后2周 治疗后4周10 0 0 0 0模型组 10 3.54 ±0.71 3.62 ±0.44 3.64 ±0.42 3.16 ±0.24甲氨蝶呤组 10 3.76 ±0.31 3.51 ±0.43 2.84 ±0.94* 1.64 ±0.36*热痹康汤高剂量组 10 3.88 ±0.57 3.54 ±0.49 2.22 ±0.52* 1.24 ±0.71*热痹康汤中剂量组 10 3.94 ±0.67 3.48 ±0.26 2.42 ±0.72* 2.21 ±0.84*热痹康汤低剂量组 10 3.87 ±0.46 3.24 ±0.45 2.72 ±0.61 2.25 ±0.42空白组*

4.2 血清IL-1β、IL-4测定 治疗4周后各给药组与模型组相比，IL-1β水平降低，IL-4水平升高，都有显著性差异(P＜0.01)。结果见表2。

表2 血清IL-1β、IL-4测定(±s，n=10)

表2 血清IL-1β、IL-4测定(±s，n=10)

注:与模型组比较，*P ＜0.01。

组别 IL-1β/pg·ml－1 IL-4/pg·ml －1 59.06 ±40.56 19.72 ±8.14模型组 486.45 ±103.42 27.95 ±14.52甲氨蝶呤组 256.86 ±86.45* 49.72 ±21.64*热痹康汤高剂量组 126.44 ±90.13* 158.44 ±46.38*热痹康汤中剂量组 261.89 ±57.23* 67.79 ±26.74*热痹康汤低剂量组 301.19 ±25.36* 45.87 ±35.64空白组*

5 讨论

类风湿关节炎是一种以关节滑膜炎症为特征的慢性全身性自身免疫性结缔组织疾病，滑膜炎可反复发作，导致关节软骨及骨质破坏，最终导致关节畸形及功能障碍，目前尚无理想的根治方法，化学合成的药物毒副作用大，患者常难坚持。中医药对RA的研究有着悠久的历史，且副作用小、疗效显著，已被越来越多的患者接受。近年来，中医药防治RA的实验研究也取得了一定的成果，从而为中医药防治本病提供了基础和依据。

其发病机理比较复杂，近年来，人们研究发现炎症性细胞因子广泛参与RA病理变化的各个阶段。对其进行深入的研究，一方面可以通过对该病发病机制的认识来了解疾病的发生、发展及预后，更重要的是可以对该病的生物学治疗提供理论依据。通过阻断主要细胞因子或细胞因子信号传递的主要环节来研究新的治疗药物是当前RA药物治疗的热点。IL-1β是一种具有广泛生物学活性的促炎性细胞因子，可以调节多种细胞因子、细胞粘附分子、免疫调节分子和前炎性介质的表达，在多种疾病的发生发展中发挥着重要作用［4］。已有研究发现IL-1β基因多态性影响疾病对治疗的反应［5，6］。IL-1β 是参与RA滑膜炎症和软骨、骨破坏的主要炎性介质，血清IL-1的水平与RA的活动性及组织形态学特征密切相关［7］，而IL-1β基因启动子区-511位点 C-T多态性能影响IL-1β的分泌量，进而影响RA病情及预后［8］，因此可将IL-1β基因作为研究RA患者对药物反应个体差异的遗传候选基因之一。

IL-4作为 Th2型细胞因子，选择性的激活STAT6，使Th0向Th2极化，分泌IL-4等Th2细胞因子，形成自身正反馈调节。Aarvak等［9］发现RA患者滑膜中Th2克隆在IL-12和IL-4单抗的作用下转化为Th0/Th1型，而Th0/Th1克隆在IL-4与IL-12单抗作用下稳定不变。此外，IL-4可以对抗IFN-γ和IL-17，而且IL-4和IL-12单抗可引发Th1/Th2在多克隆T细胞中的平衡，这是可能是由于记忆CD8+T细胞的增多和记忆CD4+T细胞的减少。IL-4对胶原诱导的关节炎 (Collagen-induced Arthritis，CIA)的进展起抑制作用，在 Thl/Th2(Th，helper T cell，辅助T细胞)平衡中，诱导Th2细胞因子转换，调节Thl细胞因子表达［10－13］，而IL-4对CIA 的保护作用，可能与阻止促进CIA进展的细胞致炎因子和肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达有关，Lubbers等［14］认为局部IL-4治疗可阻止关节损伤和骨侵蚀，这种保护作用与破骨样细胞形成因子IL-17、IL-6、IL-12以及关节炎骨蛋白整合素下调有关。

热痹康汤是庞学丰主任医师治疗湿热型活动期类风湿关节炎的经验方，由秦艽、防风、桂枝、威灵仙、制川乌、地龙、桑枝、葛根、忍冬藤、青风藤、黄柏、苍术组成，具有清热利湿、除痹止痛功效。临床应用热痹康胶囊治疗湿热型类风湿关节炎患者，发现能明显降低患者的血沉、C反应蛋白、类风湿因子、免疫球蛋白，能明显改善患者的晨僵、关节疼痛、关节肿胀、关节压痛及关节功能，长期应用发现疗效肯定，无明显毒副作用，且具有免疫调节作用［15］。

本实验采用热痹康汤和甲氨蝶呤进行对照研究，治疗后血清IL-1β水平和关节肿胀指数呈相应降低，血清IL-4水平相应升高，关节炎的症状逐渐减轻，两者与模型组比较，均有显著性差异(P＜0.01)，其作用与甲氨蝶呤相当。结果提示热痹康汤能减轻胶原诱导性关节炎大鼠关节肿胀指数，降低IL-1β水平，升高IL-4水平，从而减轻关节滑膜的炎症，抑制关节滑膜增殖，是其治疗类风湿关节炎的作用机理之一。

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