夏天无提取物基本理化性质研究*

★ 吴安明 桂婵 徐兰 杨小妹 何雁 简晖 (1.江西天施康中药股份有限公司 鹰潭5000;.江西中医学院 南昌0004;.深圳市南山区蛇口人民医院 深圳518067)

夏天无为罂粟科植物状生紫堇Corydalis decumbens(Thunb.)Pers.的干燥块茎，是江西省著名的民间草药，具有活血止痛，舒筋活络，祛风除湿之功效，用于中风偏瘫，头痛，跌扑损伤，风湿痹痛，腰腿疼痛等［1］，主要含有毕枯枯林(bicuculline，BI)、原阿片碱(protopine，PRO)、延胡索乙素(tetrahydropalmatine，THP)、巴马汀(palmatine，PAL)等生物碱。药理实验表明，夏天无生物碱具有增加心肌营养性流量、扩张外周血管、脑血管和下肢血管、对抗血小板聚集、松弛平滑肌、抑制实验性血栓形成、镇静、镇痛等作用，近来有研究报道夏天无总生物碱具有抗胆碱酯酶活性［2］。为了提高夏天无的疗效，充分发挥夏天无的疗效，我们采用乙醇提取，离子交换树脂精制得到了夏天无提取物(生物碱类成分含量大于50%)，药理实验证明具有较好的镇痛消炎等作用。本试验以 BI、PRO、THP、PAL 为指标，对夏天无提取物的基本理化性质如表观溶解度、表观油水分配系数、粉体学性质以及在高温高湿强光照射条件下的稳定性进行研究，为夏天无提取物的制剂处方设计和制备工艺研究提供参考。

1 仪器与材料

美国Agilent 1100高效液相色谱仪(配DAD、低压四元泵、在线脱气装置、自动进样器、Chemstation工作站)(Agilent科技有限公司);Milli-Q纯水处理系统(美国MILLIPORE公司);HH-2型数显恒温水浴锅(金坛市江南仪器厂);AL104-01电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);PB-10型pH酸度计(北京赛多利斯仪器系统有限公司);KQ-250E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);SHZ-82气浴恒温振荡器(常州国华电器有限公司);LRH-250-S恒温恒湿培养箱(广东医疗器械厂);LS-2000A低温恒温光照仪(上海黄海药检所);101-3-BS-Ⅱ电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂)。

BI、PRO、THP、PAL 对照品(批号分别为 1022-101019、1369-100918、1361-080213、1024-101019，纯度＞98%，均购至中药固体制剂技术国家工程研究中心);夏天无提取物(自制，含 BI4.68%、PAL2.44%、THP10.45%、PRO38.53%);甲醇(色谱纯，上海振兴化工一厂);乙腈(色谱纯，山东蜀王实验有限公司);其他试剂均为分析纯;配制溶液所用水均为双重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 夏天无提取物和指标成分在不同介质中的表观油水分配系数实验

将蒸馏水与正辛醇混合后室温搅拌24 h，静置过夜，分层后得水饱和的正辛醇和正辛醇饱和的水。取适量夏天无提取物粉末溶解于被水饱和的正辛醇中，制成药物的正辛醇溶液(精密吸取1 mL药物的正辛醇溶液置恒重坩埚内，干燥至恒重，精密称重，记为m总)。精密吸取上清液5 mL于离心筒中，分别加入正辛醇饱和的水、pH 5、pH 6、pH 7.2、pH 8磷酸盐缓冲液各30 mL，封口膜封口后，于37℃恒温振荡器中振摇48 h，离心(5000 r·min－1，15 min)后取下层水相，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液按照文献方法进行含量测定［3］，计算夏天无提取物4个指标成分的浓度。吸取上层正辛醇液置恒重坩埚内，干燥至恒重，精密称重，记为m正。

精密移取1 mL药物的正辛醇溶液，氮气吹干，加10 mL 甲醇，涡旋5 min，离心(5000 r·min－1，10 min)后取上清液过微孔滤膜，取续滤液注入HPLC，按外标法以峰面积计算夏天无提取物4个指标成分的浓度，即为各成分的初始浓度ρ。

按下列方程式计算BI、PRO、THP和PAL的表观油水分配系数(Papp):

ρ为BI、PRO、THP和PAL在正辛醇中的初始浓度(μg·mL－1);υ为被水饱和的正辛醇体积(5 mL);ρw为药物分配平衡时在水相中测得的 BI、PRO、THP和 PAL的浓度(μg·mL－1);υw 为水相体积(30 mL)。

按下列方程式计算夏天无提取物的表观油水分配系数(Papp)。

其中，m总为1 mL药物的正辛醇溶液干燥恒重后，夏天无提取物的重量(g);m正为样品中正辛醇层夏天无提取物的重量(g)。

夏天无提取物和4个指标成分在正辛醇-不同介质中的logPapp值见表1。由表1可知，除了蒸馏水外，水相介质的pH值越大，夏天无提取物和4个指标的成分logPapp值越大，说明介质的pH会显著影响夏天无提取物和4个指标成分的logPapp。在蒸馏水中，提取物和各指标成分的logPapp值大小顺序为:BI＞提取物＞THP＞PAL＞PRO，表明BI的脂溶性最好。当磷酸盐缓冲液的pH小于7.2时，THP的logPapp值最大，而pH值为8.0时，BI的logPapp值最大。

表1 夏天无提取物和4个指标成分在不同溶剂中的logPapp

2.2 夏天无提取物和指标成分在不同介质中的表观溶解度实验

在10 mL离心筒中分别加入9 mL以下介质:蒸馏水、无水乙醇、pH 5、pH 6、pH 7.2、pH 8 磷酸盐缓冲液。取过量夏天无提取物加入离心筒中，放置于(37±1)℃恒温培养振荡器中振摇96 h，于24、48、72、96 h 分别取适量上清液 1.5 mL，经 0.45 μm 微孔滤膜滤过，精密移取续滤液1 mL置恒重坩埚内，干燥至恒重，精密称重，记为m总。另外取续滤液按照上述色谱条件测定各个时间段夏天无提取物中4个指标成分的浓度。另精密移取1 mL pH 5、pH 6、pH 7.2、pH 8空白磷酸盐缓冲液置恒重坩埚内，干燥至恒重，精密称量，记为m盐，则提取物的重量等于m总减m盐。

夏天无提取物和4个指标成分在不同介质中的表观溶解度见表2。样品振摇96 h后，夏天提取物和4个指标成分的溶解度在不同介质中均达到平衡。夏天无提取物和4个指标成分在无水乙醇中的表观溶解度最大，指标成分溶解度的大小顺序为PRO＞BI＞THP＞PAL，但在蒸馏水中的表观溶解度最小。磷酸缓冲溶液的pH值越大，夏天无提取物和指标成分的表观溶解度越小。

表2 夏天无提取物和指标成分在不同溶剂中表观溶解度

2.3 夏天无提取物粉体学基本性质的测定

2.3.1 振实密度的测定 取过100目筛的夏天无提取物粉末适量，精密称重后转移至10 mL量筒内，然后将量筒自10 cm高度处自然下落到垫有泡沫的实验台上，直至粉末体积不再变化为止，读取其容积V1，用量筒中样品量W1除以最后容积，计算样品的振实密度，重复操作6次，取平均值，计算得出夏天无提取物粉末振实密度的平均值为0.84 g/cm3。

2.3.2 堆密度的测定 取过100目筛的夏天无提取物粉末适量，精密称重后转移至10 mL量筒内，不施加任何外力，读取其容积V2，用量筒中样品量W2除以最后容积，计算样品的振实密度，重复操作6次，取平均值，计算得出夏天无提取物粉末堆密度的平均值为 0.42 g/cm3。

2.3.3 休止角的测定 采用固定漏斗法测量夏天无提取物粉末的休止角:将三个漏斗串联并固定于水平放置的坐标纸上1 cm高度处，将已过100目筛的夏天无提取物粉末沿漏斗壁倒入最上的漏斗中，直到坐标纸上形成的粉末圆锥体尖接触到最下面的漏斗口为止，由坐标纸测出圆锥底部的直径(2R)，测定其堆高H，根据tan θ=H/R求出休止角，重复操作6次，求平均值。结果测得夏天无提取物粉末的休止角为50.40°。休止角θ＜30°时流动性很好，θ＞45°时流动性差，θ≤40°时可以满足生产过程中流动性的需求，而本实验测得的休止角θ＞45°，表明夏天无提取物粉末流动性不佳。

2.4 稳定性影响因素试验

参照2010年中国药典第二部附录ⅪⅩC中关于原料药稳定性试验指导原则对杏香兔耳风提取物进行影响因素试验［3］。

夏天无提取物中4个指标成分在高温、高湿、强光照射环境中的含量变化见表3。由表3可知，样品在高温、高湿、强光照射条件下放置10天后，夏天无提取物中4个指标成分的含量变化不显著，说明夏天无提取物对光、湿、热不敏感。在相对湿度为95%的环境下，提取物的吸湿率小于0.15%，说明提取物不易吸湿，且提取物粉末的外观无明显变化，提示夏天无提取物中4个指标成分的稳定性较好。

表3 BI、PRO、THP 和 PAL 在高温高湿强光照射条件下含量变化(±s，n=3)

表3 BI、PRO、THP 和 PAL 在高温高湿强光照射条件下含量变化(±s，n=3)

条件 第5天降解残存百分率/%BI PRO THP PAL高温 100.6 ±23.41 99.41 ±1.83 97.3 ±2.42 98.34 ±13.64强光 100.84 ±0.86 96.23 ±5.40 95.63 ±2.48 97.42 ±6.53高湿 101.99 ±6.36 97.93 ±4.09 102.27 ±5.74 99.73 ±2.17条件 第10天降解残存百分率/%BI PRO THP PAL高温 99.8 ±2.04 100.52 ±0.67 101.7 ±1.16 99.88 ±2.41强光 102.25 ±3.55 98.46 ±6.19 99.34 ±6.45 103.03 ±2.55高湿 102.01 ±2.34 95.81 ±1.58 95.11 ±1.88 102.73 ±4.83

3 讨论

夏天无提取物的成分复杂，限于条件限制，不能对其中成分逐一测定。本实验测定了夏天无提取物和4个指标成分的表观溶解度和表观油水分配系数。采用重量法测定夏天无提取物在介质中的含量，对提取物的表观溶解度和表观油水分配系数有了初步了解，而用HPLC法测定介质中4个指标成分的含量，能够准确测定4个指标成分的表观溶解度和油水分配系数。综合两者实验结果，更有助于了解夏天无提取物的基本性质，可为选择制剂处方与工艺、确定溶出度测定方法、预测口服吸收行为提供参考。

表观溶解度结果表明，夏天无提取物在蒸馏水中几乎不溶，4个指标成分表观溶解度的大小为THP＞PAL＞THP＞BI。夏天无提取物和4个指标成分的表观溶解度随介质pH值的减小而增加，但增加的程度不同，是因为4个指标成分的碱性大小不同，在酸性环境中可成盐，溶解度提高。夏天无提取物和4个指标成分在无水乙醇中的表观溶解度明显大于水，表明夏天无提取物有一定的亲脂性。

细胞膜的类脂性要求药物只有透过类脂膜才能容易被体内吸收，故药物的脂溶性是药物吸收重要影响因素，而药物的脂溶性取决于它本身的分子结构及所处pH条件下的分子型比例［4，5］。表观溶解度和表观油水分配系数结果表明，夏天无提取物中4个指标成分为弱碱性。当pH值较大时，指标成分以游离碱分子型为主，溶解度减小，油水分配系数增大，即脂溶性提高;当pH较小时，指标成分以离子型为主，溶解度增大，油水分配系数减小，即脂溶性降低，可预测夏天无提取物的口服吸收与pH值密切相关。

粉体学基本性质的测定可为制剂的处方工艺设计提供重要的试验依据，流动性会影响粉体的产品质量均匀性，堆密度的大小会影响粉体的充填性。试验研究结果表明，夏天无提取物粉末休止角为50.40°，振实密度为 0.84 g/cm3，说明夏天无提取物流动性欠佳，堆密度较小，在制剂工艺中可能会出现充填不均匀，重量差异较大等问题，故在处方设计时，可通过制粒或加入适量的助流剂等方法予以预防。稳定性影响因素试验表明，高温、高湿、强光照射对夏天无提取物指标成分的含量变化无显著影响。因夏天无提取物是经离子交换树脂精致纯化后得到，除去了大部分多糖、蛋白类、鞣质等易吸潮成分，因此夏天无提取物粉末不易吸潮。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:982.

［2］盛瑞，顾振纶，蒋航，等.夏天无对小鼠学习记忆及脑内乙酰胆碱酯酶的影响［J］.中草药，2003，34(6):543 －545.

［3］国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:附录176.

［4］王亚乐，贾晓斌，陈彦，等.淫羊藿苷平衡溶解度和表观油水分配系数的测定［J］.中华中医药杂志，2008，9:779 －780.

［5］王英姿，任天池，孙秀梅.高乌甲素的油水分配系数及透皮吸收速率常数的相关性研究［J］.山东中医药大学学报，2006，30(2):155－156.