当归的指纹图谱和Q-TOF-MS质谱联用研究*

★ 罗丹 刘智华 潘纯国 朱根华＊＊ (.江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室 南昌330004;.江西省肿瘤医院 南昌33009)

当归为伞形科植物当归Angelica Sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，药用历史悠久，历代本草均有记载，始载于《神农本草经》，谓之“当归味温，主呢逆上气”被列为中品。主产于我国甘肃崛县和宕昌，另外云南、四川、陕西、湖北等地亦有种植。当归性甘、辛、温，入肝、心、脾经。具补血，活血，调经，润肠之功效［1－4］。，应用 HPLC 法建立当归的指纹图谱，并对当归中的8种成分进行了定性研究，为建立其质量标准的提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪(DAD检测器、自动进样器、柱温箱);ChemStation工作站(Agilent科技有限公司，美国)，中药色谱指纹图谱相似度评价系统(国家药典委员会，2004A版)，Millipore-Q超纯水仪(Millipore Corporation，美国)，KQ-700DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，BS224S型电子天平(赛多利斯，北京)。美国Waters ACQU ITY UPLC/Q-TOF-MS系统，采用电喷雾电离(ESI)，二元高压泵、在线脱气装置、自动进器、柱温箱和TUV检测器。数据采集与处理采用Masslynx 4.1软件。甲醇为色谱纯(美国，TED I A公司)，甲酸为色谱纯(美国，DIMA公司)，水为超纯水器所制 (德国，Sartorius公司)。

1.2 试药

甲醇(色谱纯、默克公司)，乙酸(色谱纯，Dikma)，超纯水自制，实验中当归药材来自于甘肃。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Phenomenex luna C18色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5μm);流动相:采用梯度洗脱，A相0.5%的乙酸水溶液，B相为乙腈;流速:1 ml/min，DAD检测器，柱温25°C线性洗脱程序见表1。采用二极管阵列检测器对检测波长进行了考察，分别记录波长在210、270、330 nm的色谱图。结果在270 nm处各色谱峰均有较好的紫外吸收，色谱信息最为丰富，并且分离度较好，可使主要色谱峰基本达到基线分离，分离效果较好，如图1。

2.2 供试品的制备

取当归药材粉碎，准确称取0.5g于具塞三角烧瓶中，加50%甲醇水溶液10 mL，超声提取30 min，离心 5 min，0.45 μm 膜滤过，备用。

图1 当归270nm色谱图

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 分别精密吸取同一供试品溶液10μl按照上述色谱条件连续进样5次，记录指纹图谱。以13号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间和相对峰面积稳定，RSD% ＜3.0，表明精密度良好。

2.3.2 重复性试验 按照样品溶液制备方法处理同一样品5份，各吸取10μl按照上述色谱条件连续进样6次，记录指纹图谱。以13号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间和相对峰面积稳定，RSD% ＜3.0，表明该试验方法的重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取同一供试品溶液分别在0，2，4，8，12 h按照上述色谱条件连续进样 5次，记录指纹图谱。以13号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间和相对峰面积稳定，RSD% ＜3.0，表明样品溶液在12h内稳定。

2.6 当归药材

HPLC-MS定性研究 本实验通过 HPLC-MSESI正离子扫描获得了当归指纹图谱的一些结构信息，对指纹图谱中的部分色谱峰进行了结构归属的初步判断，结合文献报道，初步鉴定出8个指纹成分的化学结构，见图2，图3，表1。

表1 HPLC-MS分析结果

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

3.1.1 检测波长的选择 利用 DAD检测器，对样品进行全波长扫描，确定最佳检测波长为270 nm。

3.1.2 流动相及洗脱方法的选择 通过考察乙腈-0.5%醋酸，甲醇-水，甲醇-0.5% 醋酸，乙腈-水等多种流动相，最终确定流动相为:甲醇-0.5%醋酸，通过不同比例的甲醇-0.5%醋酸对样品洗脱能力的考察和摸索，本实验最终采用不断调节流动相比例和极性，并能达到最佳的分离效果的梯度洗脱作为实验条件。

3.1.3 流速的选择 本实验考察了不同流速(0.8，1.0，1.2 mL/min)对色谱图的影响，1.2 mL/min和0.8 mL/min的流速分离效果差，1.0 mL/min的流速分离效果好且时间合适，符合指纹图谱1 h的适宜时间，因此流速选择1.0 mL/min。

3.2 样品提取方法的选择

本实验分别采用超声和回流提取方法，发现两种方法所得组分相当，由于回流提取法较复杂，故本实验采用超声提取法根据不同种醇在不同浓度时的提取结果，得出甲醇提取效率充分，且70%的甲醇提取效率最佳最后确定样品提取方法为70%甲醇超声提取。

为了更有效地控制当归药材的质量，使其符合现代中药研究及质量控制要求，本实验对该药材建立HPLC指纹图谱，结果表明，这种方法稳定，可靠并且简便，同时充分体现其综合化，宏观化和可量化等优于其他鉴别手段的优势，该法可用以对中药材和中成药进行真伪鉴别，评价原料药材，半成品和成品质量的均一性和稳定性等，本实验同时利用HPLC-MS等手段在获得较多结构信息的同时，对当归化学成分进行了初步定性分析，鉴定出8个化合物，可为当归化学成分的进一步研究及质量控制提供参考［6－8］。

通过HPLC-TOF-MS确定的精确质量数、可能分子式，并对HPLC-TRAP-MSn可采用正离子模式和负离子模式两种，预实验发现，正离子模式比负离子模式相比出峰多，响应好。这可能与当归中为有机酸，生物碱类的物质，其比较容易形成［M+1］+或［M+Na］+，在负离子模式下都有很好的响应，最后确定采用采集正离子模式下的总离子流图。HPLC-TOF/MS，利用所得化合物离子的精确质荷比进行分子式匹配。

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