苦丁茶紫外图谱共有峰率和变异峰率双指标序列分析法

庞涛涛 (山西师范大学分析测试中心， 山西 临汾 041004)

张绪言 (山西华润煤业有限公司，山西 太原 030001)

苦丁茶紫外图谱共有峰率和变异峰率双指标序列分析法

庞涛涛 (山西师范大学分析测试中心， 山西 临汾 041004)

张绪言 (山西华润煤业有限公司，山西 太原 030001)

用3种溶剂氯仿、无水乙醇及水，系统提取苦丁茶等不同极性区间成分，测定其紫外图谱，研究样品的异同，采用图谱共有峰率和变异峰率双指标序列分析法分析苦丁茶紫外图谱。结果表明：该方法可以准确地区分不同产地和不同级别的苦丁茶。利用共有峰率和变异峰率双指标序列分析法可以对2个或多个样品进行方便可靠的鉴别，是一种符合中药自身特点的光谱指纹图谱分析方法。

苦丁茶；双指标法；共有峰率；变异峰率；序列分析

苦丁茶系冬青科植物大叶冬青(llexlatifoliaThunb)的干燥叶，是我国南部和西南部民间常用的药用植物,具有散风热、清头目、除烦渴、止头疼等功效。苦丁茶在我国分布较广，不同的产地其品质各异。因此建立一种快速、准确的鉴别苦丁茶的方法，对苦丁茶的质量监控具有十分重要的意义。

各种现代仪器已广泛应用于中药质量控制研究中，其中光谱分析由于其操作简便，稳定性好，测试速度快和测试成本低而被广泛应用。紫外图谱分析采用间隔一定波长取测量数据，建立大的数据集，进行数理统计分析[1-3]，可以对多个样本进行准确的分类，考虑到生物样品各类成分之间的非对称性关系,根据药材自身具有遗传稳定性和变异性的生物学特点,建立了共有峰率和变异峰率双指标序列分析法。用该法可以对不同中药样品做出定量且细致的区别,可以对至少2个样品进行定量鉴别。研究发现,与红外指纹图谱[4-8]、HPLC 指纹图谱[9]比较,中药紫外指纹图谱有着最好的稳定性及重复性。

本研究采用3种溶剂系统提取中药不同极性区间的成分，分别测定它们的指纹图谱，可以给出十几个特征吸收峰数据。借助于紫外光谱[10]用共有峰率和变异峰率双指标序列法研究了不同产地、不同级别苦丁茶的紫外图谱，结果表明该方法可以较好地鉴别不同产地及不同级别的苦丁茶。

1 实验部分

1.1 实验仪器和试剂

UV-2201型紫外-可见分光光度计(日本岛津)、KH-250B型超声波清洗器、无水乙醇(分析纯)、氯仿(分析纯)、二次蒸馏水。测试样品来源于浙江、海南(二级，一级，特级)、四川(特级，一级，特级)、云南、广西(一级，特级)、广东6个产地共11种苦丁茶，编号依次为K1～K11。

1.2 测试样品制备及测试条件

样品加入各种提取溶剂，分别在室温下采用超声方法提取45min可达到最大且稳定的提取率。测定波长200～600nm，狭缝2.0nm，采样间隔0.2nm。

1.3 紫外指纹图谱测试液制备

将药材粉末过100目筛,精密称取0.250g，置于具塞50ml锥形瓶中，精密加入20ml氯仿，超声提取45min，过滤，用氯仿洗涤，收集洗涤液，定容至25ml，作为待测液，挥干样品所带氯仿，加入20ml无水乙醇，超声提取45min，过滤、洗涤得25ml无水乙醇提取液，水提取液方法同。氯仿测定原液或稀释1～2倍，无水乙醇提取液稀释5倍，水提取液稀释10倍(使最大光密度Dlt;2或接近2)，以对应的溶剂为参比溶液进行紫外图谱测定。

2 结果与分析

2.1 紫外指纹图谱共有峰的确定

表1 苦丁茶氯仿、无水乙醇和水提取液紫外指纹图谱共有吸收峰波长 nm

对于紫外光谱图谱，可采用中药指纹图谱共有峰的理论识别方法W正态分布检验判别法，对各种共有峰进行识别。而对于一组非常接近的吸收峰，它们相差很小，但不满足正态分布，可采用如下方法确定共有峰：对于一组吸收峰，若组内吸收峰波长的最大差异显著小于该组与相邻组之间的平均波数差，就确定该组峰是一组共有峰。结果见表1。

2.2苦丁茶紫外指纹图谱共有峰率和变异峰率双指标序列

共性鉴别指标：(1)共有峰率P=(共有峰数Ng/2个UV图中的独立峰数Nd)·100%。(2)共有峰数Ng：指在比较的2个UV图中都出现的吸收峰的个数。(3)独立峰：紫外图谱中不同的吸收峰。na：图谱a中相对与其共有峰的非共有峰数，称为a的变异峰数。nb：图谱中b相对与其共有峰的非共有峰数，称为b的变异峰数。(4)独立峰数Nd：相互比较的2个UV图中的独立峰总数Nd=Ng+na+nb。

变异鉴别指标：变异峰率Pv：一个图谱的变异峰率Pv是该UV图中相对于共有峰的变异峰数与其共有峰数的比值Pva= (na/Ng)·100%。Pva：图谱a的变异峰率；Pvb= (nb/Ng)·100%。Pvb：图谱b的变异峰率。

11个苦丁茶样品的双指标序列如下：

K1:K9K10(60.00;50.0,16.7) K4(54.5;50.0,33.3) K8K11(50.00;80.0,20.0) K2K3(45.5;80.0,40.0) K5K7(35.7;80.0,100.0) K6(26.7;125.0,150.0)

K2:K4(87.5;0,14.3) K3(75.0;16.7,16.7) K1(45.5;40.0,80.0) K8(44.4;75.0,50.0) K5K7(41.7;40.0,100.0) K10(40.0;75.0,75.0) K6(30.8;75.0,150.0) K9(27.3;133.3,133.3) K11(25.0;200.0,100.0)

K3:K4(87.5;0,14.3) K2(75.0;16.7,16.7) K1(45.5;40.0,80.0) K8(44.4;75.0,50.0) K5K6K7(41.7;40.0,100.0) K10(40.0;75.0,75.0) K11(30.0;133.3,100.0) K9(27.3;133.3,133.3)

K4:K2K3(87.5;14.3,0) K8(55.6;60.0,20.0) K1(54.5;33.3,50.0) K5K7(50.0;33.3,66.7) K11(40.0;100.0,50.0) K6(38.5;60.0,100.0) K9K10(36.4;100.0,75.0)

K5:K6K7(81.8;11.1,11.1) K4(50.0;66.7,33.3) K8K11(45.5;100.0,20.0) K2K3K9K10(41.7;100.0,40.0) K1(35.7;100.0,80.0)

K6:K5K7(81.8;11.1,11.1) K3(41.7;100.0,40.0) K4(38.5;100.0,60.0) K8K11(33.3;150.0,50.0) K2K9K10(30.8;150.0,75.0) K1(26.7;150.0,125.0)

K7:K5K6(81.8;11.1,11.1) K4(50.0;66.7,33.3) K8K11(45.5;100.0,20.0) K2K3K9K10(41.7;100.0,40.0) K1(35.7;100.0,80.0)

K8:K11(71.4;20.0,20.0) K9K11(62.5;20.0,40.0) K4(55.6;20.0,60.0) K1(50.0;20.0,80.0) K5K7(45.5;20.0,100.0) K2K3(44.4;50.0,75.0) K6(33.3;50.0,150.0)

K9:K10(85.7;16.7,0) K11(75.0;16.7,16.7) K8(62.5;40.0,20.0) K1(60.0;16.7,50.0) K5K7(41.7;40.0,100.0) K4(36.4;75.0,100.0) K6(30.8;75.0,150.0) K2K3(27.3;133.3,133.3)

K10:K9(85.7;16.7,0) K11(75.0;16.7,16.7) K8(62.5;40.0,20.0) K1(60.0;16.7,50.0) K5K7(41.7;40.0,100.0) K2K3(40.0;75.0,75.0) K4(36.4;75.0,100.0) K6(30.8;75.0,150.0)

K11:K9K10(75.0;16.7,16.7) K8(71.4;20.0,20.0) K1(50.0;20.0,80.0) K5K7(45.5;20.0,100.0) K4(40.0;50.0,100.0) K6(33.3;50.0,150.0) K3(30.0;100.0,133.3) K2(25.0;100.0,20.0)

*K9:K10(85.7;16.7,0)表示该序列以K9为标准计算其他样品图谱的共有峰率和变异峰率，该序列片断表示K9和K10的共有峰率是85.7，其中K9的变异峰率为16.7，K10的变异峰率为0，K7:K5K6(81.8;11.1,11.1)表示K5K6与K7的共有峰率相等，为81.8，K5K6与K7具有相同的变异峰率11.1。

由上述序列可知，在不同的序列中，不同样品的共有峰率不同，样品之间的关系一般不同。利用该n维双指标序列空间可以方便地找到某一样品的最相近样品，从而可以避免在单一序列空间中比较不同样品。从上述序列看，该分析方法得到的结论可靠。

因此，利用n个样品为标准建立n维共有峰率和变异峰率序列空间，可以更合理地建立不同样品之间最直接的相似性联系，得到更合理的鉴别结论。与某一样品具有相同共有峰率的样品，往往具有不同的变异峰率，或者与某一样品具有相同变异峰率的样品，往往具有不同的共有峰率，因而双指标指纹图谱分析方法较单指标分析法具有更高的分辨率，利用双指标分析法可以对样品进行更深层次的区分及认同。如：K2:K8(44.4;75.0,50.0) K10(40.0;75.0,75.0) K6(30.8;75.0,150.0)中K2与K8K10K6具有相同的变异峰率，但K2和K8、K10与K6的共有峰率不同，分别是44.4、40.0与30.8，可以更好地做出区分。K3:K5K6K7(41.7;40.0,100.0)中K5K6K7与K3具有相同的共有峰率及变异峰率，说明K5K6K7三者相对于K3，它们确实非常相似。

2.3 11种苦丁茶的基本关系组、对及分析

A:K2:K4(87.5;0,14.3) K3(75.0;16.7,16.7),K3:K4(87.5;0,14.3) K2(75.0;16.7,16.7),K4:K2K3(87.5;14.3,0)

在A组中上述实验结果表明：K2、K3、K4海南3种苦丁茶关系最近，且相似程度最高。

B:K1:K8K11(50.00;80.0,20.0),K5:K8K11(45.5;100.0,20.0),K6:K8K11(33.3;150.0,50.0),K7:K8K11(45.5;100.0,20.0)

在B组中，上述实验结果表明：相对于浙江和四川苦丁茶而言，云南和广东苦丁茶共有峰率一样，即在不同产地的苦丁茶中，云南和广东苦丁茶相似程度最大。

C:K2:K10(40.0;75.0,75.0) K9(27.3;133.3,133.3) K3:K10(40.0;75.0,75.0) K9(27.3;133.3,133.3)

K11:K4(40.0;50.0,100.0) K3(30.0;100.0,133.3) K2(25.0;100.0,20.0)

相对于海南一级和二级苦丁茶而言，广西两种级别苦丁茶共有峰率大小顺序为：K10gt;K9，即：特级gt;一级。相对于广东苦丁茶而言，海南3种级别苦丁茶共有峰率大小顺序为K4gt;K3gt;K2，即：特级gt;一级gt;二级。由11种苦丁茶的双指标序列可以看出：对于同一产地的苦丁茶来说，相对于任何一种苦丁茶来说，K5K7gt;K6，即：四川特级gt;四川一级。因此，利用共有峰率和变异峰率双指标序列分析法，可以对上述11种苦丁茶给出符合实际情况的鉴别结论。

从变异峰率看，不同产地的苦丁茶之间的变异峰率最大，如：K1:K6(26.7;125.0,150.0)。同一产地不同级别的苦丁茶之间的变异峰率较小，如：K2:K3(75.0;16.7,16.7)。而同一产地级别相同的苦丁茶之间的变异峰率最小，如：K2:K4(87.5;0,14.3)，这正确的反映了实际情况。

上述分析表明，不同产地，同一产地不同级别及同一级别之间均存在着明显的差异。从多维共有峰率和变异峰率双指标序列分析法可以得到更多的信息，对不同产地、不同级别具有准确、精细且非常直观的鉴别能力。

3 结论

本研究结果表明，氯仿、无水乙醇和水3种溶剂紫外图谱吸收峰的共性和差异可以用多维共有峰率和变异峰率序列以数量精确地表示出来，因而三溶剂紫外图谱共有峰率和变异峰率双指标序列分析法是一种新的精确鉴别中药的方法。

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10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.01.010

O657.32

A

1673-1409(2012)01-S035-03

2011-12-10

庞涛涛(1980-),女,山西文水人,博士生,研究方向为药物分析。