胰腺癌XAF1基因启动子甲基化及其蛋白表达的相关性

赵永福 杨红星 唐哲

胰腺癌XAF1基因启动子甲基化及其蛋白表达的相关性

赵永福 杨红星 唐哲

XIAP相关因子1(XIAP-associated factor 1,XAF1)是一个新发现可以拮抗XIAP抗凋亡作用的蛋白，可以逆转XIAP对细胞的保护作用。它在所有胚胎组织及成人正常组织中广泛表达，但在许多肿瘤组织和肿瘤细胞株中低表达甚至不表达，是一种潜在的肿瘤抑制因子[1-3]。XAF1位点的杂合性缺失及XAF1启动子区的CpG岛甲基化可能是其表达被抑制的机制[4-6]。本研究检测XAF1蛋白在胰腺癌、胰腺良性疾病及正常胰腺组织中的表达及XAF1甲基化状态，分析它们之间的相关性，探讨其在胰腺癌发生、发展中的作用。

一、材料和方法

1．临床资料：收集郑州大学第一附属医院2008年1月至2011年1月间48例临床资料齐备的手术切除的胰腺癌标本、26例胰腺良性病变标本(胰岛素瘤20例，慢性胰腺炎6例)和15例正常胰腺标本(外伤切除胰腺6例，十二指肠肿物切除获得的正常胰腺9例)，所有标本均经病理学证实。胰腺癌患者中男36例，女12例，年龄37～75岁，其中≤55岁者13例，>55岁者35例，中位年龄61岁，术前均未给予放疗、化疗；胰腺良性疾病患者中男 9例，女 17例；正常胰腺组中男9例，女6例。

2．XAF1基因启动子甲基化状态检测：采用生工生物工程(上海)有限公司的UNIQ-10柱式动物基因组DNA抽提试剂盒提取组织DNA；采用EZ DNA Methylation-GoldTMKit(ZYMO公司)对DNA进行亚硫酸盐修饰；采用GENMED基因甲基化特异性PCR扩增试剂盒(GENMED公司)进行扩增。XAF1引物参考文献[7-8]，甲基化引物上游为5′-TTTGTAAGAAACGAAATTTAATCGA-3′，下游为5′-CCTACCCTTAAAACCCACGAT-3′，扩增片段228 bp。未甲基化引物上游为5′-TTTGTAAGAAATGAAATTTAATTGA-3′；下游为5′-CTCCTACCCTTAAAACCCACAAT-3′，扩增片段230 bp。甲基化循环参数：95℃ 9 min，95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，35个循环，72℃ 5 min。未甲基化循环参数：94℃ 9 min，94℃ 30 s、54℃ 45 s、72℃ 30 s，35个循环，72℃ 5 min。取PCR扩增产物，电泳分离，紫外灯下观察并摄像。

3．XAF1蛋白检测：采用免疫组化法。兔抗人XAF1多克隆抗体购自美国SANTA CRUZ公司，SP9001试剂盒及DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。结果判断：XAF1 蛋白主要位于胞核和胞质,亦表达于核膜，出现棕黄色颗粒为阳性染色。每例观察5个高倍视野，根据肿瘤细胞染色程度及阳性细胞百分数进行评分。无阳性细胞为0分，阳性细胞<20%为1分，20%～75%为2分， >75%为3分；无着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄或棕褐色为3分。两分相乘，0～3分为阴性，4～9分为阳性。

4．统计学处理：采用SPSS17.0统计软件进行分析。各组蛋白表达阳性率采用Fisher精确检验和χ2检验。相关性分析采用配对四格表的关联性分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

二、结果

1．胰腺癌、胰腺良性疾病及正常胰腺组织中的XAF1基因启动子甲基化状态：在胰腺癌、胰腺良性疾病及正常胰腺组织中XAF1基因甲基化率分别为31.3%(15/48)、7.7%(2/26)和0(0/15),胰腺癌组织XAF1甲基化频率较胰腺良性疾病及正常胰腺组织显著增高 (χ2=5.289,P=0.021；χ2=6.152，P=0.013)，后两组间的差异无统计学意义(χ2=1.213，P=0.27，图1)。

M：DNA Marker；1：阴性对照；2、3：胰腺癌组织；4、5：正常胰腺组织；m：甲基化引物；u：未甲基化引物

图1胰腺癌和正常胰腺组织中XAF1基因启动子甲基化状态

2．胰腺癌、胰腺良性疾病及正常胰腺组织中XAF1蛋白的表达：胰腺癌、胰腺良性疾病及正常胰腺组织中XAF1蛋白表达阳性率分别为52.1%(25/48)、84.6%(22/26)、88.9%(16/18)，癌组织XAF1表达率显著低于胰腺良性疾病及正常胰腺组织(χ2值为25.98、23.57，P值均<0.05，图2)，而后两组间差异无统计学意义(χ2=0.000，P>0.05)。胰腺癌组织XAF1蛋白表达与XFA1基因甲基化呈负相关(r=-0.463，P<0.05)。

图2胰腺癌(a)和正常胰腺组织(b)的XAF1表达 (免疫组化 ×200 )

3．胰腺癌中XAF1基因启动子甲基化及蛋白表达与临床病理特征的关系： XAF1基因启动子甲基化及其蛋白的表达与临床分期、肿瘤组织病理分级及有无淋巴结转移均有关(P值均<0.05)，与患者性别、年龄及肿瘤大小、肿瘤部位均无关(P值均>0.05，表1)。

表1胰腺癌中XAF1基因启动子甲基化及蛋白表达与临床病理特征的关系

临床病理特征例数XAF1基因甲基化(例)χ2值P值XAF1表达阳性(例)χ2值P值性别 男3692.6180.106180.2500.617 女1267年龄(岁) ≤551350.4320.51180.0100.920 >55351017肿瘤部位 胰头3592.1830.140170.6390.424 胰体尾1368肿瘤大小 ≤33382.4140.120151.8590.173(cm) >315710淋巴结转移 有191320.2250.00065.2980.021 无29219分化程度 高1314.6050.032104.40850.036 中低351415临床分期 Ⅰ～Ⅱ25213.1270.000188.2930.004 Ⅲ～Ⅳ23137

讨论DNA甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，在DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的作用下，将CpG二核苷酸中5′端的胞嘧啶转变为5′甲基胞嘧啶的过程，即在胞嘧啶的5′碳位共价结合了一个甲基(-CH3)。大量的研究表明，抑癌基因的沉默与其甲基化状态相关[9-10]。

XAF1基因位于人类染色体17p13.2位点,有8个外显子，由301个氨基酸组成，分子质量为33 1000，含有7个锌指结构。XAF1蛋白定位于胞质和胞核内。 XAF1过表达可使细胞停滞于G2/M期，从而抑制肿瘤细胞生长[5]。研究表明，多种肿瘤细胞株及肿瘤组织XAF1 mRNA低表达，如胃癌、结直肠癌、肝癌、肾透明细胞癌、前列腺癌和小细胞肺癌等[10-12]。XAF1 mRNA低表达与XAF1基因启动子区异常高甲基化有关，且与肿瘤的分期、分级有关[13-15]。

本研究结果显示，胰腺癌组织XAF1基因的甲基化发生率高于胰腺良性疾病及正常胰腺组织；XAF1蛋白表达阳性率显著低于胰腺良性疾病及正常胰腺组织，证实XAF1低表达与其启动子的高甲基化呈负相关。本研究还显示，胰腺癌组织XAF1蛋白的表达与临床分期、肿瘤分化程度及有无淋巴结转移有关，提示XAF1反映胰腺癌的恶性程度及预后，有望成为判断恶性程度及预后的的生物学指标之一，并有可能为指导胰腺癌的药物治疗提供一个新的思路和靶点。

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10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.019

450052 郑州，郑州大学第一附属医院肝胆胰腺外科

赵永福，Email:yanghongxing1126@163.com

2012-02-23)

(本文编辑：吕芳萍)