饲料中三聚氰胺的HPLC检测方法研究

王莉丽，刘连利，张 杰，王 洋

（(渤海大学 科技实验中心，辽宁 锦州 121013)

分析测试

饲料中三聚氰胺的HPLC检测方法研究

王莉丽，刘连利，张 杰，王 洋

（(渤海大学 科技实验中心，辽宁 锦州 121013)

饲料样品前处理时分别考察了提取液用量、沉淀剂用量、提取时间等因素对检测结果的影响，得到最佳前处理条件：提取液为乙腈+水+5%的三氯乙酸(8 mL+14 mL+20 mL)，沉淀剂为2 mL，超声提取时间25 min。采用HPLC法测试，外标法定量，方法的检出限为0.2 µg/mL，相对标准偏差为2.44%，回收率在88.3%～94.3%之间，20 min内可以完成一个样品的分析测定，建立了一种简便、快捷、准确的测定方法。

高效液相色谱法；饲料；三聚氰胺

三聚氰胺(Melamine)是一种重要的氮杂环有机化工原料，氮含量很高，生产成本很低，在饲料工业中是一种粘合剂，在饲料中添加三聚氰胺可提高产品中总氮的含量，从而提高蛋白含量测定值。一些不法企业在饲料中添加三聚氰胺，不仅对养殖业产生不利影响, 对人类健康也存在着严重威胁。自从美国发现动物的尿液结晶和肾脏细胞中有三聚氰胺[1]，食品中三聚氰胺进入食物供应链的问题[2]引起了高度关注。目前，我国明令禁止在任何饲料中使用三聚氰胺。三聚氰胺传统的检测方法有重量法、升华法、离子交换色谱法[3]、高效液相色谱质谱法[4-7]和气质联用法[8]，但这些方法检出限较高 (5 mg/kg或更高)或仅能检测简单的基质，或存在检测成本较高的问题，或回收率较低，不能完全满足饲料中三聚氰胺的检测需要。本文采用的高效液相色谱法[9-11]具有高效、高灵敏度等优点，利用二极管阵列检测器定性，外标法定量，检测成本低于质谱法，测量结果准确度也较高，通过对前处理条件的考察，建立了一套准确、可靠、灵敏度高的饲料中三聚氰胺的检测方法。

1 实验部分

1.1 实验仪器

高效液相色谱仪（美国Agilent 1100）；万能粉碎机（鄄城威瑞科教仪器有限公司 DGF-100）；涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司QL-901型）；高功率数控超声清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司KH-200KDB型）；电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司 DGG-9053AD型）；高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机有限公司 TGL-20M型）；氮吹仪(北京万诚博达科贸有限公司 HGC-12A型)

1.2 实验试剂

甲醇（色谱纯）；乙腈（色谱纯）；水（18.2 M Ω）；氨水（分析纯）；混合型阳离子交换固相萃取柱（60 mg，3 mL）；三氯乙酸（色谱纯）；乙酸铅（分析纯）；滤膜（0.22 µm）；三聚氰胺标准品：纯度≥99%，Sigma公司。

1.3 标准溶液配制

称取100 mg（精确到0.1 mg）的三聚氰胺标准品，用甲醇溶液溶解并定容至100 mL，制备浓度为1 mg/mL标准储备溶液。将标准储备溶液稀释制成1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 µg/mL的标准工作溶液。

1.4 色谱条件

Eclipse XDB-C8柱，4.6 mm×300 mm，5 µm；流动相：庚烷磺酸钠-已腈(92+8)；流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：5 µL/次；进样方式：手动进样。检测波长：240 nm。

1.5 试样制备

用万能粉碎机将饲料样品粉碎，然后过160目筛子。称取过筛后的饲料样品5.00 g于50 mL具塞塑料管中，加入2.0 mL 5%的乙酸铅溶液，20 mL三氯乙酸溶液，8 mL乙腈，用水定容至50 mL。涡旋混匀，超声提取25 min，然后在5 000 r/min离心机上离心10 min，取上清液备用。分别用3 mL甲醇，3 mL水活化混合型阳离子交换固相萃取柱，准确移取 10 mL上清液分次上柱，控制过柱速度在 1 mL/min以内。再用3 mL水，3 mL甲醇洗涤混合型阳离子交换固相萃取柱，抽近干后用3 mL氨水甲醇溶液洗脱。洗脱液 50 ℃氮气吹干，准确加入甲醇溶液1 mL，涡旋震荡1 min，过0.45 µm滤膜，上机测定。每个样品平行处理3份。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的选择

2.1.1 提取液的选择

对于食品和饲料样品, 一般采用乙腈- 水溶剂体系进行提取, 以减少共萃取组分。本实验采用 20 mL三氯乙酸和乙腈混合溶液提取，分别考察了不同比例 5%三氯乙酸与乙腈的提取液用量对实验回收率的影响，加10 mL、15 mL三氯乙酸时，回收率低，三聚氰胺提取不完全，加入三氯乙酸过多时，从液相色谱图上可以看出三氯乙酸提取了过多的饲料中的杂质，导致回收率降低。由此可知5%三氯乙酸20 mL，乙腈加入量为8 mL，加入的水约为14 mL为比较好的提取液比例，此时实验回收率达91.0%。

表1 三氯乙酸与乙腈用量对回收率的影响Table 1 Effect of the acetocaustin and acetonitrile dosage on

2.1.2 沉淀剂及用量的选择此

饲料成分复杂，有些饲料用离心机离心时分离不好，加入沉淀剂可以增强离心效果。用乙酸铅作为沉淀剂，分别加入0.5、1、2、3 mL乙酸铅，通过实验，用量达2 mL时，沉淀效果就很好。

2.1.3 提取时间的选择

三聚氰胺是强极性化合物，溶解性很弱，提取时间对回收率影响很大，因此分别比较了超声5、10、15、20、25、30 min的提取效率，实验结果如表 2所示。超声25 min以上可以得到较好的回收率。超声25 min时回收率可达90.3%。

表2 超声提取时间对回收率的影响Table 2 Effect of ultrasound extraction time on the recoveries

2.2 标准曲线的测定

测得1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、80.0、150.0 µg/mL的标准工作溶液所得的峰面积与所对应的标准溶液浓度进行直线回归分析，峰面积(Y)与三聚氰胺浓度(X) 呈良好的线性关系，直线回归方程为Y=74.033X+58.633，相关系数R=0.9993。

2.3 最小检出限的测定

采用50 µg/mL的标准溶液进样，估算2倍噪音峰高时随对应的各标准物质的浓度，以5倍估算浓度值为起点进样，用乙腈逐渐稀释三军氰胺标准溶液，确定2倍噪音峰高时所对应的三聚氰胺浓度，即三聚氰胺的最小检出限，测得最小检出限为 0.2 µg/mL。最小定量限为最小检出限的 5倍，最小定量限为1 µg/mL。

2.4 精密度和回收率实验

连续进6次三聚氰胺5 µg/mL标准溶液进行测定，三聚氰胺测得峰面积的相对标准偏差为3.6%，精密度高，保证了方法的有效性。添加回收率实验的样品处理同上述2.5试样制备步骤。三聚氰胺标准物质在饲料样品中的添加量为25、50、100 µg/g。每个添加浓度平行测定 3次，回收率测得值在88.3%~94.3%之间，平均值为91.04%，回收率较高。精密度和回收率数据如表3所示。

表3 精密度和回收率实验数据表Table 3 Datas of the precision and the recoveries

2.5 样品待测组分的测定

图1和图2分别为三聚氰胺标准溶液的色谱图和加标的饲料样品色谱图。图1中三聚氰胺的出峰位置为15.007 min，由加标的饲料样品色谱图可见，由于样品前处理采用提取液为乙腈-水-5%的三氯乙酸（8 mL+14 mL+20 mL），提取的杂质少，因此色谱峰比较少，三聚氰胺的出峰位置为14.908 min，三聚氰胺色谱峰与其他峰完全分开，峰形良好，不受其他提取物的干扰。

图1 三聚氰胺标准溶液色谱图Fig.1 Chromatograghy of the melamine standard solution

图2 加标饲料样品的色谱图Fig.2 Chromatography of the feed sample added the standard substance

3 结 论

本文采用高效液相色谱法测定饲料中三聚氰胺含量。样品的预处理简单，操作简便快速，精密度、准确度较好，回收率完全符合分析要求。饲料样品前处理采用提取液为乙腈+水+5%的三氯乙酸(8 mL+14 mL+20 mL)，乙酸铅沉淀剂2 mL，超声提取时间25 min，提取杂质少，色谱峰干扰小, 适合饲料中三聚氰胺的检测。

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Study of the Melamine Determination in feed By HPLC

WANG Li-li, LIU Lian-li, ZHANG Jie, WANG Yang
（Center for science& Experiment technology，Bohai university，Liaoning Province Jinzhou 121013，China）

In the pre-treatment step of feed samples, the factors were studied to affect on detect consult such as the amount of extraction agent, the amount of precipitant and extraction time. The optimal pre-treatment method was obtained: the extraction agent is acetonitrile-water-5% acetocaustin (8mL+14mL+20mL), the amount of precipitant is 2ml and ultrasound extraction time is 25min. HPLC and ESTD was adopted to determine the content of the melamine in feed. The determination limit was 0.2µg·mL-1; the relative standard deviation was 2.44% and the mean recoveries were from 88.3% to 94.3%. The determination of one sample is within 20 minutes. A simple, quick and accurate analysis method were established.

HPLC；Feed；Melamine

O 657

A

1671-0460（2012）05-0547-03

2012-03-24

王莉丽（1980-），女，辽宁辽阳人，实验师，硕士，2005年毕业于东北大学冶金物理化学专业，主要从事化学分析方法及化学分析仪器的功能开发研究。E-mail：wanglili1980@163.com。