超高效液相色谱-串联质谱法同时测定饲料中的7种β2-兴奋剂

卢艳芬，徐丽君，王 辉，王志明，颜克旭

(长沙市畜禽水产品质量检测中心，湖南 长沙 410013)

2012-05-11；

2012-08-24

长沙市科技局现代农业与健康科技重大专项(K1003024-21)资助

卢艳芬(1968～)，女(汉族)，副研究员，从事动物源性产品质量安全管理和检测。E-mail:Lubabana@126.com

超高效液相色谱-串联质谱法同时测定饲料中的7种β2-兴奋剂

卢艳芬，徐丽君，王 辉，王志明，颜克旭

(长沙市畜禽水产品质量检测中心，湖南 长沙 410013)

为了准确测定饲料中7种β2-兴奋剂，建立了超高效液相色谱-串联质谱检测方法。样品经酸性有机混合溶剂提取、固相萃取净化浓缩后，在多反应监测模式下,用带电喷雾离子源(ESI)的串联质谱仪对样品进行定性和定量分析。该方法下各化合物定量检出限为50 μg/kg。在50、100、200 μg/kg的添加浓度下，回收率在71%～103%之间，相对标准偏差在5.7%～9.8%之间。本方法快速、准确、灵敏度高，适合饲料中福莫特罗、苯乙醇胺A、克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布它林、西马特罗的同时快速检测。

超高效液相色谱-串联质谱法；β2-兴奋剂；饲料；残留

β2-兴奋剂(β2-agonist)属于苯乙胺类药物，俗称瘦肉精，既不是兽药，也不是饲料添加剂，药理效应上属于拟肾上腺素药物。这些违禁药物高剂量添加在饲料中，可以选择性地作用于肾上腺素，导致动物体内的脂肪分解代谢增强，增加蛋白质的合成，显著提高胴体瘦肉率[1-3]。在经济利益驱动下，不法分子违禁在饲料中添加此类药物的情况时有发生。农业部早在2002年2月发布的193号公告《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》中就将其列为违禁药物。这几年来，农业部一直将β2-兴奋剂类药物列入重点监测项目之一。由于多年来对克仑特罗的严厉监管，犯罪分子转而添加同类替代药物，比如：莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A等，导致中毒事件的屡屡发生。β2-兴奋剂的滥用严重威胁着人们的身体健康[3-4]，农业部于2010年12月再次发文(农业部公告第1519号)，禁止在饲料和动物饮水中使用苯乙醇胺A、福莫特罗等物质。因此，设计多组分的同时测定方法，在实际监督和执法工作中对饲料进行实时监测势在必行，以期从源头进行监控。

有关β2-兴奋剂的分析测定方法涉及(气相、液相)色谱法、(气相、液相)色谱-质谱法、酶联免疫吸附法、放射免疫测定法等[5-19]。实际工作中，多采用液相色谱-质谱联用法进行确证，因为此法可以同时满足高灵敏度、高选择性的定性定量要求。由于现有国家标准或农业部公告中还没有关于饲料中苯乙醇胺A、福莫特罗、克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布它林、西马特罗同时测定的方法，而在实际监督执法工作中又迫切需要相关的分析技术予以支撑。为此，本工作进行相关的研究，建立同时测定饲料中的7种β2-兴奋剂的超高效液相色谱-串联质谱方法。

1 实验方法

1.1主要仪器和设备

UPLC-MS/MS：美国Waters公司产品；离心机(湘仪H-1650)；固相萃取装置(Alltech)；pH计(雷磁PHSJ-4A)；涡旋混匀器：德国IKA公司产品；振荡器(苏州威尔SHA-C)；超声仪(昆山KQ-500DE)；沙浴氮气吹干仪(美国N-EVAPTM112)。

1.2试剂及耗材

苯乙醇胺A标准品(纯度大于98.0%)：多伦多化学研究公司产品；莱克多巴胺、克仑特罗、西马特罗、特布他林、沙丁胺醇、福莫特罗标准品(纯度均大于98.0%)：Dr. Ehrenstorfer GmbH公司产品；甲醇和甲酸：均为色谱纯；氨水、盐酸和氢氧化钠：均为分析纯；固相萃取小柱(MCX、HLB：60 mg/3 mL)：美国Waters公司产品。

1.3实验条件

1.3.1液相色谱条件 色谱柱：BEH C18(50 m×2.1 mm×1.7 μm)；流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：甲醇溶液；梯度洗脱：0～3.4 min，维持95%A；3.4～3.6 min，95%A变化至72%A；3.6～5.5 min，维持72%A；5.5～5.7 min，72%A变化至30%A；5.7～6.7 min，维持30%A；6.7～8 min, 30%A变化至95%A。流速：0.3 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：4 μL。

1.3.2质谱条件 电喷雾离子源；正离子扫描；多反应检测模式；电离电压：3.0 kV；源温：120 ℃；雾化温度：350 ℃；锥孔气流速：50 L/h；雾化气流速：580 L/h。7种化合物的保留时间、定性定量离子对及锥孔电压、碰撞能量等质谱参数列于表1。

1.4样品前处理

1.4.1提取 准确称取2 g试样于50 mL离心管中，加入10 mL提取液(V(0.1 mol/L盐酸)∶V(甲醇)=8∶2)，充分振荡后超声10 min, 以5 000 r/min离心5 min，上清液全部转移到另一离心管中，残渣用上述方法重复提取1次。合并上清液，用10 mol/L氢氧化钠溶液调节至pH 4，待用。

1.4.2净化 依次用3 mL甲醇、3 mL水活化固相萃取小柱，准确移取5 mL上清液上柱。再依次用3 mL 0.1 mol/L盐酸溶液、3 mL甲醇淋洗，抽干，3 mL 5%氨化甲醇洗脱，收集洗脱液于5 mL离心管中，45 ℃下用氮气吹干。用1.0 mL流动相溶解，涡旋混匀后过有机微孔滤膜，上机测定。

表1 7种β2-受体激动剂最优化的质谱条件

2 结果与讨论

2.1净化条件的优化

由于饲料中添加了很多物质，成分复杂，使得提取后的样品本底复杂，容易对各目标化合物的测定造成基质抑制。为了提高灵敏度、降低检出限，样品提取后需进一步进行前处理净化富集。通常的净化方式有液-液萃取法和固相萃取法(SPE)。液-液萃取法虽然对去除基质有较好的效果，但对于不同结构的药物类型，其回收率差别较大，同时液-液萃取会消耗大量的有机溶剂，对环境造成不利影响。因此，本工作采用SPE法。

由于本实验中的7个化合物既有苯酚型又有苯胺型，因此设计的净化方案需要适合全部目标化合物。研究了各种净化条件对重现性、回收率的影响以及色谱、质谱中各目标峰和杂质的分离情况。

选取了Oasis MCX和HLB两种小柱进行比对。研究了上样溶液的pH值对回收率的影响情况，结果示于图1、图2。从图中可以看出，对于MCX小柱，当上样溶液的pH值在4时，7种化合物的回收率均较好；对于HLB小柱，当上样溶液pH值为7时，7种化合物的回收率相对较高。实验显示，HLB小柱的净化能力不如MCX小柱，即在样品加标实验时，杂质峰多，不能满足高灵敏度的检测要求。故本实验最终采用MCX小柱进行固相萃取净化处理。

图1 上样溶液pH值和回收率的关系图(MCX柱)Fig.1 Relation schema of solution’s pH and recovery(MCX)

图2 上样溶液pH值和回收率的关系图(HLB柱) Fig.2 Relation schema of solution’s pH and recovery(HLB)

2.2方法的线性关系和测定限

2.2.1方法的线性关系 用流动相配制成浓度分别为0.5、1、5、10、20、50 μg/L的系列混合标准工作溶液，在确定的实验条件下进样分析。以浓度为横坐标、峰面积响应值为纵坐标，绘制标准工作曲线。如表2所示，各相关系数均大于0.999，方法的线性范围宽，线性关系良好。

2.2.2方法的灵敏度 测定了不同饲料样品的最低检测限，确定本方法的定量限。在本方法中，各种受体激动剂的方法最低定量限(LOQ)为50 μg/kg。该浓度下饲料中各目标化合物的提取离子质谱图示于图3。从图中可以看出，在此定量限下，各目标化合物分离良好，信噪比S/N>10。

表2 7种β2受体激动剂的标准工作曲线

图3 50 μg/kg加标饲料中7种β2-兴奋剂的提取离子色谱图 Fig.3 Extracted ion chromatogram of 7 β2-agonists for a spiked feed sample(50 μg/kg)

2.3方法的精密度和准确度

对本方法的准确度和精密度进行了考察。以空白饲料样品进行3个浓度的添加回收实验，每个浓度进行6次以上的平行测定。福莫特罗、苯乙醇胺A、西马特罗、特布他林、沙丁胺醇、莱克多巴胺、克仑特罗的添加浓度为50、100和200 μg/kg时，测得各目标化合物的回收率和变异系数列于表3。各化合物的回收率在71%～103%之间，相对标准偏差在5.7%～9.8%之间。

表3 精密度和准确度实验结果

3 结论

本工作建立的饲料中7种β2-兴奋剂的多残留UPLC-MS/MS检测方法，简单、快速、有机溶剂消耗少，方法精密度和准确度高，实用性强，为相关的监督执法工作提供了快速准确的技术支持，可为养殖业健康有序发展提供技术保障。

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SimultaneousDeterminationof7Kindsofβ2-agonistinFeedbyUPLC-MS/MS

LU Yan-fen, XU Li-jun,WANG Hui, WANG Zhi-ming, YAN Ke-xu

(ChangshaQualityTestingCenterofLivestockPoultryandAquaticProducts,Changsha410013,China)

A method of ultra performance liquid chromatograghy-electrospray tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) was studied for determination ofβ2-agonist in feed. The sample was extracted by 0.1 mol/L hydrochloric acid-methanol mixed solvent, purified and enriched with cationic solid phase extraction column， and which was separated by liquid chromatography on C18column with mobile phase of 0.1% formic acid in methanol(gradient elution), then analyzed in UPLC-MS/MS with electrospray ion source(ESI) under multi-reaction monitor mode(MRM). The quantification was performed with external standard method. The method has a lower limit of quantitation 50 μg/kg. Spike recoveries of three concentration addition levels(50, 100, 200 μg/kg) ranged in 71%—103% with relative standard deviations in 5.7%—9.8%. The method is fast, accurate and sensitive. It is suitable for rapid qualitative and quantitative detection ofβ2-agonist in animal feed.

ultra performance liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);β2-agonist; feed; residue determination

O 657.63

A

1004-2997(2012)05-0280-06