Akt-eNOS-NO信号途径介导了Ang-1和Ang-2对大鼠失血性休克早期血管高反应性的调节作用*

徐 竞， 蓝 丹， 杨光明， 李 涛， 刘良明

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所二室，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆 400042)

1000-4718(2012)09-1554-05

2011-10-25

2012-07-16

国家自然科学基金资助项目(No.30801189);重庆市自然科学基金资助项目(No. 2008BB5103)

△通讯作者 Tel: 023-68757421;E-mail：Liuliangming2002@yahoo.com

Akt-eNOS-NO信号途径介导了Ang-1和Ang-2对大鼠失血性休克早期血管高反应性的调节作用*

徐 竞， 蓝 丹， 杨光明， 李 涛， 刘良明△

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所二室，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆 400042)

目的观察内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)在血管生成素1(angiopoietin-1, Ang-1)和血管生成素2(angiopoietin-2, Ang-2)调节失血性休克大鼠血管反应性双相变化中的作用及其机制。方法采用Western blotting技术观察失血性休克后不同时点肠系膜上动脉(superior mesenteric artery，SMA)中eNOS蛋白表达变化，采用离体微血管环张力测定技术观察eNOS抑制剂对Ang-1和Ang-2调节缺氧早期和晚期血管反应性作用的影响，并观察给予Ang-1、Ang-2以及Tie-2、Akt、p38 MAPK、ERK抑制剂后缺氧血管内皮细胞(vascular endothelial cells, VECs)和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)混合培养物中eNOS蛋白表达和培养上清一氧化氮(nitric oxide, NO)含量的影响。结果(1) eNOS在正常SMA中表达很低，失血性休克后逐渐增高，休克10 min、30 min、1 h、2 h和4 h时分别增高至正常对照的1.95、2.10、3.01、3.42和3.57倍(P<0.01)。(2)eNOS抑制剂可显著抑制缺氧10 min的血管高反应性，去甲肾上腺素(NE)的Emax由13.479 mN降低至9.043 mN (P<0.01)，也可以显著抑制Ang-1对缺氧10 min血管高反应性的维持作用，NE的Emax由15.283 mN降低至11.219 mN (P<0.01)，但不改变Ang-2降低缺氧10 min血管高反应性作用，也不改变缺氧4 h的血管低反应性和Ang-1、 Ang-2对缺氧4 h血管反应性的调节作用。(3)缺氧10 min的eNOS表达较正常对照增高，Ang-2和Tie-2、Akt抑制剂可抑制其增高(P<0.01)，p38 MAPK、ERK抑制剂对其无显著影响。(4)NO含量在缺氧10 min显著增高，Ang-2和Tie-2、Akt、eNOS抑制剂可抑制其增高 (P<0.01)，p38 MAPK、ERK抑制剂对其无显著影响。结论失血性休克早期，Ang-1和Ang-2通过Akt-eNOS-NO途径来调节血管高反应性。

失血性休克； 血管反应性； 双相变化； 血管生成素1； 血管生成素2； 内皮型一氧化氮合酶

血管生成素1(angiopoietin-1, Ang-1)和血管生成素2(angiopoietin-2, Ang-2)属于血管内皮细胞(vascular endothelia cells, VECs)特异的促血管新生因子家族——血管生成素家族，本实验室前期研究发现，Ang-1和Ang-2在失血性休克后的肠系膜上动脉(superior mesenteric artery，SMA)中呈时间上的差异表达，并通过Tie-2受体参与了失血性休克血管反应性双相变化的形成[1]，蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/Akt)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)几种分子参与了其调节过程，但具体的调节机制如何，目前尚不清楚。 根据基础研究，Ang-1和Ang-2激活VECs上的Tie-2受体之后，可经磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)激活Akt，还可经过衔接蛋白Grb2活化p38 MAPK和ERK，再通过调节内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)产生一氧化氮(nitric oxide, NO)[2-3]，而NO具有调节血管舒缩反应性的作用[4]。那么Ang-1和Ang-2是否通过Akt、p38 MAPK和ERK，调节eNOS产生NO，来调节失血性休克血管反应性的双相变化？ 本实验采用Western blotting技术和离体微血管环张力测定技术，以大鼠SMA以及混合培养的VECs和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)为研究对象，观察失血性休克后不同时点SMA中eNOS蛋白表达变化，eNOS抑制剂对Ang-1和Ang-2调节缺氧早期和晚期血管反应性作用的影响，给予Ang-1、Ang-2以及Tie-2、Akt、p38 MAPK和ERK抑制剂后缺氧培养的VECs和VSMCs中eNOS蛋白表达和培养上清NO含量的变化，以探讨eNOS在Ang-1和Ang-2调节休克血管反应性双相变化中的作用及其信号途径。

材 料 和 方 法

1动物和细胞准备

采用第三军医大学大坪医院实验动物中心清洁级SD大鼠，雌雄各半，体重200～230 g，戊巴比妥钠(30 mg/kg大鼠体重)腹腔注射麻醉。

根据文献分别进行VECs 和VSMCs原代细胞培养[5]，取第3代至第5代的VECs 和VSMCs细胞，按照细胞计数1∶1比例进行混合培养，次日进行实验。

2动物分组和方法

2.1失血性休克后eNOS的蛋白表达变化 将48只大鼠麻醉后右侧股动脉插管接血压计[6]，随机分组为：正常对照组、休克10 min、30 min、1 h、2 h、4 h组，每组8只，制作40 mmHg失血性休克模型，并按各组要求维持不同休克时间。休克完成后，活杀大鼠取SMA组织，常规Western blotting技术测定eNOS的蛋白表达。Quantity One软件分析蛋白条带，以eNOS/β-actin吸光度值之比反映eNOS蛋白表达。

2.2eNOS抑制剂对Ang-1和Ang-2调节缺氧早期和晚期血管反应性的影响 取大鼠104只，麻醉后活杀取SMA一级分支血管环，随机分为：正常对照组、缺氧10 min组、Ang-1+缺氧10 min组、Ang-2+缺氧10 min组、eNOS抑制剂+缺氧10 min组、eNOS抑制剂+Ang-1+缺氧10 min组、eNOS抑制剂+Ang-2+缺氧10 min组、缺氧4 h组、Ang-1+缺氧4 h组、Ang-2+缺氧4 h组和eNOS抑制剂+缺氧4 h组、eNOS抑制剂+Ang-1+缺氧4 h组、eNOS抑制剂+Ang-2+缺氧4 h组，每组8只血管环。将血管环浸入无糖Krebs-Henseleit(K-H)液中，进行药物处理，采用Ang-1和Ang-2的浓度均为200 μg/L，eNOS抑制剂L-N5-亚氨基乙基鸟氨酸二盐酸盐(L-N5-iminoethyl ornithine dihydrochloride,L-NIO)浓度为1×10-4mol/L。然后将血管环置于缺氧罐中，依次充入缺氧气体(5%CO2和95%N2)15 min和夹闭10 min，循环5次，最后1次充气完成后，按各实验组要求分别夹闭10 min或4 h完成缺氧[6]。再取出缺氧处理完成的血管环，将其固定在微血管肌动描记仪上，浸入K-H液中，采用累积浓度法检测微血管环对梯度浓度去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)的反应性，作量-效曲线，曲线拟合法求NE的最大收缩力 (Emax)，以NE的Emax评价血管反应性[7]。

2.3Ang-1和Ang-2调节缺氧早期血管高反应性时eNOS的蛋白表达变化和NO的含量变化 取混合培养的VECs 和VSMCs细胞32瓶，随机分为：正常对照组、缺氧10 min组、Ang-2+缺氧10 min组、Tie-2抑制剂+缺氧10 min组、Akt抑制剂+缺氧10 min组、p38MAPK抑制剂+缺氧10 min组、ERK抑制剂+缺氧10 min组和eNOS抑制剂+缺氧10 min组，每组4瓶。先将细胞培养基换做无血清培养基，进行药物处理，Ang-1和Ang-2的浓度均为200 μg/L,Tie-2抑制剂为1∶100封闭抗体，Akt抑制剂 1×10-5mol/L,p38 MAPK抑制剂SB203580 1×10-5mol/L,ERK抑制剂PD98059 1×10-5mol/L，eNOS抑制剂L-NIO 1×10-4mol/L。再进行不同时间缺氧处理(方法同前面SMA的缺氧处理)。完毕后取细胞培养上清，采用一氧化氮检测试剂盒测定NO含量，收集细胞用于测定eNOS的蛋白表达。

3统计学处理

结 果

1失血性休克后eNOS的蛋白表达变化

eNOS在正常时表达很低(与β-actin的比值为0.0720)，失血性休克后表达逐渐增高。休克1 min、30 min、1 h、2 h和4 h时分别增高至0.1407、0.1509、0.2173、0.2462和0.2571 (P<0.01)，见图1。

2eNOS抑制剂对Ang-1和Ang-2调节缺氧早期和晚期血管反应性的影响

eNOS抑制剂可显著抑制缺氧10 min的血管高反应性，表现为量效曲线右移，NE的Emax由13.479 mN降低至9.043 mN (P<0.01)，也可以显著抑制Ang-1对缺氧10 min血管高反应性的维持作用，表现为量效曲线右移，NE的Emax由15.283 mN降低至11.219 mN (P<0.01)，但不改变Ang-2降低缺氧10 min血管高反应性作用，也不改变缺氧4 h的血管低反应性和Ang-1、Ang-2对缺氧4 h血管反应性的调节作用，见图2。

图1失血性休克后eNOS蛋白表达

3Ang-1和Ang-2调节缺氧早期血管反应性时eNOS的蛋白表达变化和NO含量变化

缺氧10 min的eNOS表达较正常对照显著增高(P<0.01)，Ang-2、Tie-2抑制剂和Akt抑制剂可抑制其增高，使其由缺氧10 min的0.1354分别降低至0.0848、0.0724和0.0993 (P<0.01)，p38 MAPK和ERK抑制剂对缺氧10 min的eNOS表达无显著影响，见图3。

NO含量在缺氧10 min即显著增高，Ang-2以及Tie-2、Akt和eNOS抑制剂可抑制其增高，使其分别降低41.88%、68.91%、70.69%和67.42% (P<0.01)，p38 MAPK和ERK抑制剂对其无显著影响，见图4。

讨 论

失血性休克后血管反应性呈早期增高和晚期降低的双相变化[8]，其发生机制尚不清楚。本实验室前期研究发现，血管生成素家族中的Ang-1和Ang-2在失血性休克后的SMA中呈时间上的差异表达(即Ang-1蛋白表达在休克早期增高，晚期降低；Ang-2蛋白表达在休克早期变化不大，在晚期逐渐增高)，并通过Tie-2受体参与了失血性休克血管反应性双相变化的形成[1]，Akt、p38 MAPK和ERK几种分子参与了其调节过程，但具体调节机制如何，尚无文献报道。

图2eNOS抑制剂对Ang-1和Ang-2调节缺氧早期和晚期血管反应性的影响

图3Ang-1和Ang-2调节缺氧早期血管反应性时eNOS蛋白的表达

根据基础研究，Ang-1和Ang-2激活VECs上的Tie-2受体之后，可经PI3K激活Akt，还可经过衔接蛋白Grb2活化p38 MAPK和ERK，再通过调节eNOS产生NO[2-3]。NO是目前已知的一种对血管舒缩反应性有重要调节作用的分子，少量NO可增高血管收缩反应性；过量NO可过度开放KATP和BKCa，导致VSMCs膜超极化，还可降低肌球蛋白轻链磷酸化，导致VSMCs钙失敏，从而降低血管舒缩反应性[4]。且有研究发现，在LPS诱导内毒素休克的人脐静脉内皮细胞，LPS通过磷酸化和活化Akt、p38 MAPK和ERK，激活eNOS，产生NO，调节内毒素休克的血管反应性[9-10]。那么，Ang-1和Ang-2是否通过Akt、p38 MAPK和ERK，调节eNOS产生NO，来调节失血性休克血管反应性的双相变化？

本实验研究发现，eNOS抑制剂可显著抑制缺氧10 min的血管高反应性，也可以显著抑制Ang-1对缺氧10 min血管高反应性的维持作用，但不改变缺氧4 h的血管低反应性和Ang-1、Ang-2对缺氧4 h血管反应性的调节作用，提示eNOS主要参与了Ang-1和Ang-2对失血性休克早期血管高反应性的调节。失血性休克后SMA中的eNOS蛋白表达逐渐增高；在缺氧培养的VECs和VSMCs混合细胞中，Ang-2以及Tie-2和Akt抑制剂可显著降低缺氧10 min的eNOS蛋白表达增高和NO含量增高，p38 MAPK和ERK抑制剂对其没有显著影响，提示失血性休克早期，Ang-1和Ang-2通过Akt调节eNOS的蛋白表达和NO产生，来调节血管高反应性。

图4Ang-1和Ang-2调节缺氧早期血管反应性时NO含量的变化

然而，本实验还发现，尽管eNOS蛋白表达在休克晚期也是增高的，却对于Ang-1和Ang-2调节休克晚期的血管低反应性作用没有显著影响，提示Akt-eNOS-NO信号途径并不介导Ang-1和Ang-2对休克晚期血管低反应性的调节，那么Ang-1和Ang-2对休克晚期血管低反应性的调节又是通过什么分子和信号通路实现的，还需要进一步研究。

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Akt-eNOS-NOsignalpathwaymediatesregulatoryeffectofAng-1andAng-2onvascularhyperreactivityinearlyhemorrhagicshockrats

XU Jing, LAN Dan, YANG Guang-ming, LI Tao, LIU Liang-ming

(StateKeyLaboratoryofTrauma,BurnandCombinedInjury,theSecondDepartmentofResearchInstituteofSurgery,DapingHospital,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China.E-mail:Liuliangming2002@yahoo.com)

AIM: To observe the role of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in the regulatory effect of angiopoietin-1 (Ang-1) and angiopoietin-2 (Ang-2) on the biphasic change of vascular reactivity after hemorrhagic shock in rats.METHODSThe protein expression of eNOS was measured in the superior mesenteric artery (SMA) after hemorrhagic shock by Western blotting. The effect of eNOS inhibitor on the vascular reactivity of SMA treated with Ang-1 and Ang-2 in the early (hyperreactivity) and late (hyporeactivity) periods of hypoxia were observed via an isolated organ perfusion system. The protein levels of eNOS in the hypoxic mixture of vascular endothelial cells (VECs) and vascular smooth muscle cells (VSMCs), and the concentration of nitric oxide (NO) in the medium supernatant of the mixture cells treated with Ang-1, Ang-2 and the inhibitors of Tie-2, Akt, p38 MAPK and ERK were measured.RESULTSThe protein expression of eNOS in SMA was low in normal control group, and increased significantly after hemorrhagic shock, which was 1.84, 3.55, 4.75, 5.96 and 6.33 folds of the normal control level in shock 10 min, 30 min, 1 h, 2 h and 4 h groups, respectively (P<0.01). Inhibitor of eNOS decreased the vascular hyperreactivity in hypoxia 10 min group, in which the Emaxof norepinephrine (NE) was decreased from 13.479 mN to 9.043 mN (P<0.05). It also repressed the maintenance effect of Ang-1 on vascular reactivity in hypoxia 10 min group, in wihich the Emaxof NE was decreased from 15.283 mN to 11.219 mN (P<0.01). The effect of Ang-2 on the vascular hyperreactivity in hypoxia 10 min group, the vascular hyporeactivity in hypoxia 4 h group, or the effect of Ang-1 or Ang-2 on the vascular reactivity in hypoxia 4 h group did not change. The protein expression of eNOS was increased 10 min after hypoxia as compared with the normal control, which was decreased by Ang-2 and the inhibitors of Tie-2 and Akt (P<0.01), but was not decreased by p38 MAPK and ERK inhibitors. The concentration of NO in the medium supernatant was increased 10 min after hypoxia, and was significantly decreased by Ang-2 and the inhibitors of Tie-2, Akt and eNOS, while the inhibitors of p38 MAPK and ERK had no influence on it.CONCLUSIONAng-1 and Ang-2 regulate the vascular hyperreactivity in the early hemorrhagic shock rats through Akt-eNOS-NO pathway.

Hemorrhagic shock; Vascular reactivity; Biphasic change; Angiopoietin-1; Angiopoietin-2; Endothelial nitric oxide synthase

R605.971

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.004