高效液相色谱法测定止痢颗粒中黄芩苷含量

郭立恒，朱山寅

(1.浙江省桐乡市第二人民医院，浙江 嘉兴 314511; 2.浙江省嘉兴市食品药品检验所，浙江 嘉兴 314001)

止痢颗粒是由黄芩、葛根、黄连、木香、槟榔、地锦草等6味中药组成的复方制剂，具有清热解毒、理气止痢功效，用于急性痢疾，收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂(第五册)》，原标准无含量测定项目[1]，也尚未见文献报道。黄芩主含黄芩苷，是本方的有效消炎成分之一。为有效控制止痢颗粒的质量，笔者建立了测定该制剂中黄芩苷含量的高效液相色谱(HPLC)法。现报道如下。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪(Waters 510/484/745B色谱系统);UV-265型紫外分光光度计(日本岛津)。黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号为0751-200912);止痢颗粒(市售品，批号分别为 090408，20090513，091225);甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯;水为重蒸馏水。

2 方法和结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Hypersil C18分析柱(150 mm×4.6 mm，5μm);流动相:甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.5);流速:1.0 mL/min;测定波长:278 nm;柱温:室温。

2.2 溶液制备

精密称取经60℃减压干燥至恒重的黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL中含0.055 mg的溶液，作为对照品溶液。取样品10 g，研细，精密称取1 g，置25 mL量瓶中，加甲醇约22 mL，超声处理30 min，放置室温，稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。按处方量制备不含黄芩药材的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

干扰试验:照上述色谱条件，吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各20μL，分别注入色谱仪。供试品溶液色谱图中，在与对照品溶液色谱图相应位置上有一相同的色谱峰，而阴性对照品溶液在此保留时间无干扰，见图1。

图1 止痢颗粒高效液相色谱图

线性关系考察:精密吸取黄芩苷对照品溶液(0.055 g/L)1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0 mL，置 10 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配成系列质量浓度的对照品溶液，按上述色谱条件，精密进样20μL。以黄芩苷峰面积积分值 Y为纵坐标、进样量 X(μg)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y=7.237×106X+9.973×104，r=0.999 4(n=9)。结果表明，黄芩苷进样量在0.10～0.51μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

精密度试验:准确吸取对照品溶液20.0μL，重复进样5次。结果黄芩苷峰面积的 RSD为1.09%(n=5)，表明仪器精密度符合要求。

稳定性试验:取同一供试品溶液，分别在制备后 0，2，4，6，8，10 h时进样。结果黄芩苷峰面积的 RSD=1.37%(n=6)，表明供试品溶液在10 h内稳定。

重现性试验:取同一批号样品5份，依法制备供试品溶液并测定。结果的 RSD=1.44%(n=6)，表明方法重现性良好。

加样回收试验:称取已知含量样品(批号为090408)6份，精密称定，精密加入黄芩苷对照品适量，照2.2项下供试品溶液制备方法制备溶液并按拟订的色谱条件进行测定。结果见表1。

2.4 样品含量测定

分别精密称取不同批号的样品粉末约1 g，依法制备供试品溶液，分别精密吸取20μL，按拟订的色谱条件测定。3批样品中黄芩苷的含量分别为0.453 2，0.449 3，0.450 2 mg/g(n=5)。

表1 黄芩苷加样回收试验结果(n=6)

3 讨论

取对照品溶液，用紫外分光光度计在200～300 nm波长范围内扫描，结果在278 nm波长处有最大吸收，故以此作为测定波长。

曾以乙醇为溶剂进行测定，样品主峰分离不佳，常有列峰现象，对照品峰形同样较差。以乙醇、50%甲醇、甲醇为溶剂对比考察线性关系，黄芩苷进样量相同的情况下，测得的峰面积乙醇最小，甲醇最大，50%甲醇略小于甲醇，r分别为0.948 4，0.980 7，0.999 4(n=6)，测得样品中黄芩苷含量的重现性甲醇最好。这说明黄芩苷在乙醇中的溶解度较差，使峰面积产生误差。

比较了几种不同比例流动相的分离效果，要使样品中的黄芩苷与杂质的分离达到要求，且峰形对称而尖锐，必须增加水和磷酸的比例，同时样品的稀释时应改为甲醇。拟订的色谱条件下，黄芩苷与其他组分能达到基线分离，理论板数大于1 500。

[1]WS3-B-0904-91，卫生部药品标准·中药成方制剂(第五册)[S].