芥子气诱导真皮成纤维细胞分泌肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的时效和量效研究

杨积顺，徐立平，胡晋红

(1.中国人民解放军第100医院药械科，江苏 苏州 215007;2.第二军医大学上海长海医院药学部，上海 200433)

银屑病是一种T细胞引发并维持的自身免疫性疾病[1]，患者机体免疫系统紊乱，健康细胞受到攻击，导致临床上出现各种形态的皮肤红斑鳞屑性炎症病变。银屑病患者全层皮肤均存在异常，真皮成纤维细胞在银屑病发展中扮演了重要的调节作用[2]。芥子气(sulfur mustard，SM)的化学名为“二氯二乙硫醚”，对皮肤有较强的渗透性。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)的胞外区与肿瘤坏死因子(TNF)和Fas蛋白的配体(FasL)有较高的同源性，属于肿瘤坏死因子超家族的新型凋亡分子，通过与靶细胞表面的受体结合而发挥生理作用。TRAIL的主要功能是参与变异细胞的凋亡，而对正常细胞没有损伤。临床经验证明，芥子气软膏对银屑病症状和机体炎性状态的改善发挥了重要作用，但其治疗机制尚不明确。本研究中探讨了芥子气对真皮成纤维细胞分泌TRAIL的影响，旨在为研究芥子气治疗银屑病的机制提供参考。

1 仪器、试药与方法

1.1 仪器、试药

单道数字可调微量移液器(日本Nichiryo公司);ELX-800型酶标仪(美国Bio-Tek instruments Inc)。血细胞计数板(上海医用光学仪器厂);细胞培养板、培养瓶、培养皿(Corning-Costar CO.，Becton Dickinson Labware)。胶原酶(CLS-1，Worthington Biochemical Corp.);分散酶，四甲基偶氮唑盐(MTT)，胰蛋白酶(tissue culture grade)均为 AMRESCO公司产品;小牛血清(GIBCO);DMEM细胞培养基(high glucose，GIBCO/BRL);二甲基亚砜(DMSO，中国医药集团上海化学试剂公司);青霉素(80万U)，链霉素(1g)，均为华北制药股份有限公司产品。Human TRAIL ELISA Kit(Bender Medsystems GmbH)。芥子气 (SM，第二军医大学防化教研室)，密度1.27 g/mL，纯度96%，液态;加入10 mL DMEM细胞培养基溶解，得浓度为500μmol/L的贮备液，使用时以DMEM细胞培养基稀释至规定浓度，现配现用。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

取采用包皮环切术切下的健康人包皮，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗净血迹，置0.05%醋酸洗必泰灭菌溶液中清洗、消毒5 min，以磷酸盐缓冲液冲洗后，尽量去除皮下组织，用手术剪刀将皮肤切成0.5 cm2大小的皮块，置0.2%的分散酶溶液中，4℃消化过夜。次日取出皮块，轻轻将消化液荡干，用镊子将表皮与真皮层分开;将分离出的真皮层剪碎，放入0.2%胶原酶溶液中，37℃消化4～5 h，去除上层胶原酶，加入15 mL含20%新生牛血清(NBS)的DMEM培养液，反复吹打成细胞悬液，过80目消毒不锈钢纱网，再过200目消毒尼龙筛网后，1 000 r/min离心10 min，弃除上清液，用20%胎牛血清(FBS)的DMEM培养液重新悬浮，制成细胞悬液，以台盼蓝染色，测定真皮细胞活力。细胞计数，接种于培养瓶中，置37℃及5%CO2的培养箱中培养，2～3 d后换液1次，待细胞生长近融合(70% ～80%)后，以0.25%胰蛋白酶溶液消化，进行传代，取第5～10代细胞用于后续试验。

1.2.2 时效关系试验

取生长良好的真皮成纤维细胞，以0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液。分别用含10%胎牛血清的DMEM培养基和含10%新生牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为1×108个/L，接种于24孔细胞培养板，置37℃及5%CO2的恒温培养箱中培养24 h，待细胞平稳生长至70%～80%融合后，换以无血清DMEM培养基，静息 24 h。用含芥子气终浓度分别为 62.50，15.63，7.81，3.91，1.95μmol/L的无血清培养基培养不同时间(24，48，72 h)，以DMEM培养基为空白对照，每组平行设3复孔。吸取上清液，1 000 r/min离心5 min，-20℃保存。采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测TRAIL的含量。

1.2.3 量效关系试验

取生长良好的真皮成纤维细胞，以0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液。分别用含10%胎牛血清的DMEM培养基和含10%新生牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为1×108个/L，接种于24孔细胞培养板，置37℃及5%CO2的恒温培养箱中培养24 h，待细胞平稳生长至70%～80%融合后，换以无血清DMEM培养基，静息24 h。以DMEM培养基为空白对照，每孔加入不同浓度的含芥子气的无血清培养基，使芥子气终浓度分别为62.50，15.63，7.81，3.91，1.95 μmol/L。每组平行设 3 复孔，继续培养24 h。吸取上清液，1 000 r/min离心5 min，-20℃保存。采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测TRAIL的含量。

1.3 统计学分析

数据以X±s表示，用SPSS10.0软件分析。

2 结果

在整个试验中，采用的是经原代培养、传代10～20代的真皮成纤维细胞。倒置相差显微镜下观察，真皮成纤维细胞呈梭形或长纤维状，胞体狭长，边界清楚，胞浆丰富，细胞核呈卵圆形，靠近胞质中央;细胞排列规则，呈漩涡状或放射状，随细胞增殖而布满培养皿底部，培养2～3 d即可融合。

用不同浓度的芥子气刺激真皮成纤维细胞24，48，72 h后，酶联免疫吸附测定结果显示，真皮成纤维细胞本身可分泌少量的TRAIL，芥子气刺激可使TRAIL的分泌量增多，并具有明显的时间和剂量依赖性。结果见表1。

表1 不同时间和浓度的芥子气刺激真皮成纤维细胞表达TRAIL的量(X ±s，n=3)

3 讨论

银屑病的组织病理既有表皮角质形成细胞的过度增生，还存在真皮乳头增生、毛细血管扩张，还有学者认为银屑病皮损也存在成纤维细胞的过度增生。本研究中所选择的芥子气浓度均对真皮成纤维细胞没有毒性，且低于临床上使用的浓度。近期研究表明，TRAIL能够阻止自身免疫性疾病的进展，可能对某些慢性自身免疫性疾病的治疗有益[3]。TRAIL能选择性诱导肿瘤细胞的凋亡，而对正常组织和细胞没有明显的毒性，是一种极具潜力的抗肿瘤坏死因子，因而受到了国内外学者的广泛重视和深入研究[4]。银屑病亦是以细胞过度增生伴炎性细胞浸润等病理改变的疾病，临床研究证实，现行许多抗癌药物对顽固性银屑病的治疗发挥了重要作用，取得了明显的临床疗效，并且诱导细胞凋亡已成为银屑病药物治疗的新目标。

本研究结果表明，真皮成纤维细胞自身可以分泌TRAIL，芥子气刺激后可以显著上调TRAIL的表达，且分泌趋势具有明显的量效和时效依赖性。因此推测，芥子气治疗银屑病的作用机制可能与其促进TRAIL的分泌，从而发挥抗银屑病效果有关。

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