急性肝内胆汁淤积大鼠肝组织法尼醇受体表达的变化及意义

姚嘉明 于芳芳 王小奇 叶 蔚 刘彬彬 刘庆生

肝内胆汁淤积是目前临床常见的一种疾病，其发生原因较为复杂，包括遗传性、感染性、药物性、酒精性、自身免疫性、妊娠性和手术后等。该病发生机制尚未完全探明，目前缺乏疗效确切的治疗药物。法尼醇受体(farnesoid X receptor，FXR)又称胆汁酸受体，属于核受体超家族成员。其可通过调控一系列基因的表达，参与胆汁酸的代谢调节，是胆汁酸合成和转运的关键调节因子。因此，其有望成为治疗肝内胆汁淤积性疾病的药物靶点。本研究使用异硫氰酸萘酯建立大鼠急性肝内胆汁淤积模型。在前期研究中笔者成功地制作了大鼠急性肝内胆汁淤积的模型，大鼠ALT、AST、TBIL、ALP及 TBA 在应用 ANIT 24h后明显升高，于48h达高峰，72h下降，模型组3时相点ALT、AST、TBIL、ALP、TBA 水平均显著高于正常组［1］。本次研究通过对该模型形成过程中大鼠肝组织中FXRmRNA及蛋白表达的变化进行动态观察，分析探讨其特点，为进一步探索肝内胆汁淤积的发病机制提供实验支持。

材料与方法

1．实验动物:SD大鼠32只，雄性，清洁级，体重190～210g，由上海市西普－必凯实验动物有限公司提供，许可证号:SCXK(沪)2008－0016，饲养于浙江中医药大学实验动物中心，饲养环境通风良好，温度18～22℃，湿度为45% ～65%。

2．主要试剂:异硫氰酸萘酯由ACROSORGANICS公司提供，FXR(H－130)兔多克隆抗体为美国Santo Cruz公司产品，Envision两步法免疫组化生物检测试剂盒为美国DAKO公司产品，AxyPrep总RNA小量制备试剂盒为爱思进生物技术有限公司产品，反转录试剂盒、Perfect Realtime－SYBR Premix EX TaqTM试剂盒均为宝生物工程(大连)有限公司;引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成:大鼠FXR上游引物:5'－GAC CAC GAA GAC CAG ATT GCT －3'，下游引物:5'－TCT CCA CTG CCT CTC TAT CCT T －3'，扩增片段 283bp;大鼠GAPDH上游引物;5'－GAC AAC TTTGGC ATCGTG GA－3'，下游引物:5'－ ATG CAG GGA TGA TGT TCT GG － 3'，扩增片段133bp。

3．分组及处理:32只SD大鼠随机分成两组，正常组8只，模型组24只。适应性常规喂养1周后，模型组一次灌服用麻油配成4%浓度的异硫氰酸萘酯(ANIT)100mg/kg体重，正常组灌服等容量的麻油;所有大鼠予以标准大鼠饲料喂养，自由饮水。模型组在灌服ANIT后24、48、72h 3个时相点随机处理7～8只，正常组于灌服麻油24h后全部处理。各大鼠于处理前16h禁食不禁水，上午空腹麻醉下取血，分离血清待用;取右叶部分肝组织，以4%多聚甲醛固定，逐级乙醇脱水，常规石蜡包埋待用;其余肝组织投入液氮中冻存，3h后移入－70℃冰箱中保存。其中正常组、模型组24h时相点各有1只大鼠因灌胃时误灌入气管导致窒息死亡。

4．检测方法:血清总胆汁酸(TBA)水平采用全自动生化仪检测。肝组织FXRmRNA表达采用Real－time PCR法，以RNA制备试剂盒抽提肝组织总RNA，经鉴定无降解、纯度高，紫外分光光度仪测OD260/OD280比值在1．8～2．0之间，根据OD260值计算总RNA浓度。以500ng总RNA为模板进行反转录，反转录反应产物于 20μl反应体积(2×SYBR10μl、10μmol/L 浓度的10μmol/L 上下引物各0．4μl、10ng/μl cDNA模板2μl、ddH2O补充体积至20μl)中进行PCR扩增，PCR反应条件:预变性95℃ ×3min;95℃ ×5s、60℃ ×45s，共 40 个循环。溶解曲线分析:95℃ ×15s，60℃ ×15s，缓慢上升至95℃×15s。以GAPDH作内参，相对表达量(2－△Ct×102)来表示目的基因mRNA的表达水平(△Ct=目的基因Ct－内参Ct)。肝组织FXR蛋白表达采用免疫组织化学Envision两步法检测，结果判定标准:根据阳性细胞的着色程度及着色范围进行半定量。阳性强度:不着色者为0分，着色淡者为1分，中等着色为2分，着色深者为3分。着色细胞阳性范围:无着色为0分，着色阳性细胞＜1/3为1分，着色阳性细胞1/3～1/2为2分，着色阳性细胞＞1/2为3分。将每张切片着色程度与着色细胞阳性范围得分各自相加为其最后计分。

5．统计学方法:采用SPSS 18．0软件包进行统计，所有数据以均数±标准差(x±s)表示，使用单因素方差分析和非参数秩和检验，相关性分析使用Spearman，P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．急性肝内胆汁淤积大鼠各时相点血清TBA 水平的变化:模型组大鼠TBA水平在灌服ANIT 24h后明显升高并达高峰，后开始下降，72h点TBA水平较24h点有明显下降(P＜0．01)。3个时相点均较正常组差异有显著性(P ＜0．01，P ＜0．05，表1)。

表1 急性肝内胆汁淤积大鼠各时相点血清TBA水平的变化(x±s)

2．急性肝内胆汁淤积大鼠各时相点肝组织FXRmRNA及蛋白表达的变化:模型组大鼠肝组织中FXRmRNA和蛋白表达在24、48及72h 3个时相点均较正常组明显下降(P ＜0．01、P ＜0．05)，其中24h最低，随时间推移，48、72h逐渐增高，而72h点FXRmRNA较24h点表达量明显增高(P＜0．05，表2)。

表2 模型组各时相点大鼠肝组织中FXR蛋白及mRNA的表达(x±s)

3．大鼠肝组织FXRmRNA表达与血清TBA水平的相关性分析:经Spearman检验，大鼠肝组织FXRm-RNA表达与血清TBA水平均呈明显的负相关(r=－0．589，P ＜0．01)。

讨 论

法尼醇受体(FXR)是核受体超家族中的一员，胆汁酸为其生理性配体，因此又称为胆汁酸受体，它在肝脏和肠道高表达，其活化能改变一系列参与调节胆汁酸代谢的基因的表达［2，3］。因此，法尼醇受体高表达对于维持胆汁酸的内环境稳态、降低胆汁酸对肝脏的毒性具有重要意义，已有研究表明，FXR激动剂可以改善肝脏疾病包括胆汁淤积、肝纤维化等［4～6］。

异硫氰酸萘酯(ANIT)能够诱发动物肝内胆汁淤积，导致明显胆管上皮细胞损伤，引起血清ALP的活性、胆汁酸和胆红素含量的升高，胆汁流量减少，同时造成肝细胞损伤，引起血清中转氨酶快速升高，类似于人类急性肝内胆汁淤积的病理改变。本实验采用其对大鼠灌胃制作急性肝内胆汁淤积模型。在用药后24、48及72h大鼠血清中TBA水平较正常组明显升高(P ＜0．01，P ＜0．05)，同时肝组织中 FXR 蛋白及FXRmRNA表达均较正常组有明显降低(P＜0.01，P＜0．05)。3个时相点血清TBA水平表现为逐渐降低，而肝组织中FXR蛋白及mRNA表达则逐渐增多，其中FXRmRNA表达与血清TBA水平均呈明显的负相关(r= －0．589，P ＜0．01)。有研究提示，大鼠在灌服ANIT 24h内就诱发了胆汁淤积，并且随时间的延长绝大部分肝功能指标呈现先加重后逐渐恢复的趋势，其中灌药后48h为肝功能损伤的高峰，至灌药后72h肝功能已有较大的恢复，与笔者的前期研究结果一致。

目前已有研究显示由乙炔雌二醇诱发的肝内胆汁淤积症孕鼠的血清TBA水平及肝组织FXRmRNA表达较对照组明显升高，FXR参与了肝内胆汁淤积的发生过程［3］。故笔者认为，在ANIT诱发的大鼠急性肝内胆汁淤积模型中，用药后24h内肝组织中FXR蛋白及mRNA的表达即出现明显下降，由此出现了胆汁酸代谢的障碍，血清胆汁酸水平上升，从而导致急性肝内胆汁淤积及肝细胞损伤，肝功能出现恶化，其后随着FXR蛋白及mRNA的表达的回升，胆汁酸代谢障碍逐渐得到缓解，血清胆汁酸水平下降，进而肝内胆汁淤积及肝细胞损伤情况得到好转。研究提示，FXR在肝内胆汁淤积肝损伤中起重要作用，通过对FXR表达的调控可能为肝内胆汁淤积的治疗提供新的手段。

1 姚嘉明，王小奇，刘庆生．清热化湿祛瘀疏肝法对急性肝内胆汁淤积大鼠的防治作用［J］．中华中医药学刊，2012，30(10):2102－2104

2 Parks DJ，Blanchard SG，Bledsoe RK，et al．Bile acids:natural ligands for an orphan nuclear receptor［J］．Science，1999，284(5418):1365－1368

3 时青云，林宇庚，周新，等．胆汁酸代谢主要调节核受体和相关基因在胆汁淤积孕鼠肝脏中的表达［J］．中华肝脏病杂志，2010，18(12):927－930

4 Renga B，Mencarelli A，Migliorati M，et al．Bile－acid－activated farnesoid X receptor regulates hydrogen sulfide productionand hepatic microcirculation［J］．World JGastroenterol，2009，15(17):2097 －2108

5 Renga B，Migliorati M，Mencarelli A，et al．Reciprocal regulation of the bile acid－activated receptor FXR and theinterferon－gamma－STAT － 1 pathway in macrophages［J］．Biochim Biophys Acta，2009，1792(6):564－573

6 Lindor KD．Farnesoid X receptor agonists for primary biliary cirrhosis［J］．Curr Opin Gastroenterol，2011，27(3):285 －288