响应面优化龙眼核原花青素的醇提工艺

彭晓莉，刘 新，陈卫中，程道梅，冷言冰

(成都医学院公共卫生系，四川成都610083)

响应面优化龙眼核原花青素的醇提工艺

彭晓莉，刘 新，陈卫中，程道梅，冷言冰*

(成都医学院公共卫生系，四川成都610083)

目的:优化龙眼核原花青素醇提条件。方法:在单因素实验的基础上，应用Box－Behnkenk中心组合实验和响应面分析法对龙眼核原花青素的醇提条件进行优化。结果:通过单因素实验确定乙醇体积分数、料液比和提取温度为优化对象。建立二次多项式回归方程预测模型Y=1.15+0.034A+0.094B+0.004C－0.036AB+0.044AC－0.11BC－0.24A2－0.23B2－0.087C2。响应面分析确定适合的反应条件为:乙醇体积分数40%，料液比1∶23(mg/mL)，提取温度为39℃。预测响应值为1.16%，验证龙眼核原花青素得率为1.12%。结论:响应面分析法确定的提取条件合理，验证值与预测值接近，可以用于龙眼核原花青素的提取。

龙眼核，原花青素，响应面

1 材料与方法

1.1 材料与设备

新鲜龙眼 广州产，品种为福眼，市售;原花青素标准品 纯度≥95%，天津尖峰天然产物开发公司生产;无水乙醇、石油醚(沸程30～60℃)、硫酸铁铵、盐酸、正丁醇 均为分析纯，成都市科龙化工试剂厂生产。

UV－1102紫外－可见光分光光度计 天美科技有限公司;THZ－82恒温振荡器 江苏天由有限公司;KDC－12低速离心机 科大创新股份有限公司中佳分公司;DHG－9053A型鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司;FY－135粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司;万分之一电子天平 北京赛多利斯系统有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 龙眼核的处理与提取 新鲜龙眼洗净，人工剥皮，取核。龙眼核放置于干燥箱，40℃干燥至恒重。粉碎后过40目标准筛，立即置入30℃石油醚中脱脂8h，阴干得实验用龙眼核粉样品，备用。准确称取龙眼核粉样品0.3mg，加入一定体积分数的乙醇溶液，放入恒温振荡器，在一定温度下振荡一定时间后取出，离心，过滤，相同方法提取两次，将滤液混合，即为龙眼核原花青素提取液。

1.2.2 原花青素标准曲线的绘制 龙眼核原花青素的检测采用正丁醇－盐酸比色法分析检测［9］。称取原花青素标准品 10.00mg，用甲醇溶解，定容至10mL，制得浓度为1.00mg/mL的标准液。再用甲醇稀释，制成浓度为 0、10、25、50、100、150、200和250μg/mL的系列标准溶液。取0.5mL系列标准溶液加入盐酸－正丁醇溶液(体积比5∶95)6mL、2%硫酸铁铵溶液0.2mL［10］，混合后置于沸水浴中进行显色反应40min，取出立即置入4℃冰浴中降温3～5min，取出冷至室温。紫外可见分光光度计550nm［11］处测定吸光度。在550nm处以试剂空白调零，测定吸光度值A，确定线性范围，绘制标准曲线，计算回归方程。线性回归方程及相关系数为 Y=0.0024X+ 0.0253，R2=0.9962，式中:Y为吸光度，X为原花青素浓度，μg/mL。

1.2.3 龙眼核原花青素的测定 取0.5mL提取液按1.2.2方法检测，查标准曲线。龙眼核原花青素计算公式为［12］:

式中:m－查标准曲线样品液OD550对应的原花青素的含量，μg;V1－待测样品的取样体积，mL;V2－样品定容体积，mL;M－样品取样质量，g;d－样品溶液稀释倍数;W－样品含水量。

1.3 龙眼核原花青素提取工艺优化

1.3.1 龙眼核原花青素提取单因素实验

1.3.1.1 乙醇体积分数对龙眼核原花青素提取效果的影响 准确称取0.3mg脱脂龙眼核粉碎粉末5组、每组3份。在料液比1∶7(mg/mL)、提取液pH=3的条件下，分别用体积分数为20%、40%、60%、80%、100%，温度40℃振荡提取40min后离心过滤。以龙眼核原花青素得率为指标，分析龙眼核原花青素得率与乙醇体积分数的关系，以确定最佳乙醇提取剂的体积分数。

1.3.1.2 料液比对龙眼核原花青素提取效果的影响准确称取0.3mg脱脂龙眼核粉碎粉末5组，每组3份。按料液比为1∶5、1∶7、1∶10、1∶12、1∶15的比例加入体积分数为50%的乙醇溶液，温度40℃振荡提取40min后离心过滤。以龙眼核原花青素得率为指标，分析料液比对龙眼核原花青素得率的影响，以确定最佳料液比。

1.3.1.3 温度对龙眼核原花青素提取效果的影响准确称取0.3mg脱脂龙眼核粉碎粉末5组，每组3份。按料液比1∶7，体积分数50%乙醇于30、40、50、60、70℃振荡提取后离心过滤，温度40℃振荡提取40min后离心过滤。以龙眼核原花青素得率为指标，分析温度对龙眼核原花青素得率的影响，以确定最佳提取温度。

1.3.1.4 提取时间对原花青素提取效果的影响 准确称取0.3mg脱脂龙眼核粉碎粉末5组，每组3份。按料液比1∶7、50%乙醇溶液，温度40℃振荡提取1、2、3、4、5h后离心过滤。以龙眼核原花青素得率为指标，分析提取时间对龙眼核原花青素得率的影响，以确定最佳提取时间。

1.3.2 响应面优化原花青素提取方法 在单因素实验的基础上，筛选出影响龙眼核原花青素提取效果的因素。以各因素为自变量，运用 Design Expert 8.0.5程序进行Box－Behnken设计，通过响应面分析法优化龙眼核原花青工素提取条件。考虑实验室条件和可行性，固定提取时间为4h，用响应面法，以龙眼核原花青素得率为响应值(因变量Y)，对乙醇体积分数(A)、料液比(B)和提取温度(C)3因素的3水平进行提取条件的优化，实验因素与水平见表1。

表1 实验因素与水平设计Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

2 结果与分析

2.1 乙醇体积分数对龙眼核原花青素提取效果的影响

由图1可见，随着乙醇体积分数增大，龙眼核原花青素得率值相应增加，乙醇体积分数为40%时得率最高。当乙醇体积分数大于40%时，得率下降，乙醇体积分数超过80%后，得率值急剧降低。可能因乙醇体积分数升高，导致一些醇溶性杂质、色素、亲脂性强的成分溶出量增加，这些物质与乙醇－水分子结合，影响原花青素的溶出［13］。此次研究确定乙醇体积分数为40%。把乙醇体积分数30%～50%作为响应面法的考察范围。

图1 不同乙醇体积分数对原花青素提取效果的影响Fig.1 Effect of alcohol fraction on the proanthocyanidins yield

2.2 料液比对龙眼核原花青素提取效果的影响

由图2可见，随着料液比的增大，龙眼核原花青素得率增加，料液比为1∶20以后，龙眼核原花青素得率下降。随着溶剂量的增加，对原花青素的提取效果也越好，当溶剂量过大时，溶液中的原花青素提取量将达到饱和，再增大溶剂量，吸光度值出现下降趋势。因此，此次研究确定料液比1∶20，把料液比1∶10～1∶30作为响应面分析的考察范围。

图2 料液比对龙眼核中原花青素提取效果的影响Fig.2 Effect of ratio of raw material to solvent on the proanthocyanidins yield

2.3 提取温度对龙眼核原花青素提取效果的影响

由图3可见，随着提取温度的升高，龙眼核原花青素得率值升高。提取温度高于40℃后，龙眼核原花青素得率值下降，60℃以后下降趋势更明显。得率值下降的原因可能是与提取物在高温下不稳定，化学性质发生改变有关。因此，此次研究确定提取温度为40℃，把温度30～50℃作为响应面的考察范围。

图3 温度对龙眼核中原花青素提取的影响Fig.3 Effect of temperature on the proanthocyanidins yield

2.4 提取时间对龙眼核原花青素提取效果的影响

由图4可见，随着提取时间的延长，龙眼核原花青素得率不断升高，当达到4h以后，龙眼核原花青素得率增加不明显。提取时间对提取的影响主要是因为传质过程需要有足够的时间达到平衡［14］，当达到一定时间后，原花青素在固－液之间的浓度基本达到了平衡，再延长时间，溶液中的原花青素浓度变化不大。考虑提取效率，此次实验确定提取时间为4h。

图4 提取时间对龙眼核中原花青素提取的影响Fig.4 Effect of time on the proanthocyanidins yield

2.5 响应面法优化提取龙眼核原花青素

2.5.1 响应面优化龙眼核原花青素提取条件 按照Design Expert 8.0.5软件中的Box－Behnken设计模式设计，见表2。

表2 Box－Behnken Design实验设计与实验响应结果Table 2 Box－Behnken Design and response result values for the proanthocyanidins yield

2.5.2 回归分析 对实验测定的龙眼核原花青素得率进行回归，建立二次回归模型。从方差分析结果可知，实验所选模型F值为7.6，P值为0.0070差异有统计学意义(P＜0.05);失拟项F值为4.52，失拟项相对于绝对误差不显著，表明该模型对实验拟合情况较好。信噪比(Adeq Precisior)的值为8.27，该模型可以用于预测。R2=0.9072表明此方程有较好的拟合度，方程与实际情况比较相符，并能作出相对准确的预测，但Pred R－Squard值与Adj R－Squared值相差很大，该响应面方程需要做进一步的优化。相应的响应面方程为:

式中:A代表乙醇体积分数，B代表料液比，C代表提取温度。

从回归方程中可以看出，各因素对龙眼核原花青素提取的影响大小顺序为:料液比＞乙醇体积分数＞提取温度。模型与方差分析结果见表3。根据回归分析结果，将建立的回归模型中的任一因素固定在零水平，得到另两个因素的交互影响结果，作出二次回归方程的响应面图，如图5～图7所示。

由图5～图7可见两两之间交互作用较显著［15］。随着乙醇体积分数和料液比增大，原花青素得率增加并在某水平达到极值。原花青素得率随提取温度增高而上升，提取温度进一步增高时，原花青素得率降低。

应用Design Expert Box－Behnken对实验进行最优化设计，得到最佳的提取条件:乙醇体积分数40%，料液比1∶23，提取温度为39℃，预测响应值龙眼核原花青素得率为1.16%。

2.5.3 验证实验 准确称取0.3mg样品，在最佳条件下提取，重复实验3次取平均值，验证实验结果。样品的平均值响应值为 1.12%，与预测值相符度为96%。

表3 模型与方差分析结果Table 3 The experiment variance analysis of response surface design

图5 乙醇体积分数和料液比对原花青素提取的影响Fig.5 Effect of alcohol fraction and ratio of raw material to solvent on the proanthocyanidins yield

图6 乙醇体积分数和提取温度对原花青素提取的影响Fig.6 Effect of alcohol fraction and temperature on the proanthocyanidins yield

图7 料液比和提取温度对原花青素提取的影响Fig.7 Effect of ratio of raw material to solvent and temperature on the proanthocyanidins yield

3 结论

响应面实验考察范围较窄，应先确定考查范围内存在最大响应值。由单因素实验结果可见，龙眼核提取液吸光度随着乙醇体积分数、料液比和提取温度的增加，出现先升后降的趋势，而在本实验最长提取时间7h内吸光度没有出现下降趋势。分析单因素实验结果，对乙醇体积分数、料液比和提取温度进行优化。结果表明，料液比、乙醇浓度对龙眼核原花青素提取液的吸光度影响大，差异具有统计学意义(P＜0.05)。响应面法优化得出龙眼核原花青素的最佳提取条件:乙醇体积分数40%，料液比1∶23，提取温度为39℃。回归分析和验证实验结果表明，经响应面优化后的提取条件合理可行。

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Optimization of ethanol extraction of proanthocyanidins from longan seed using response surface analysis

PENG Xiao－li，LIU Xin，CHEN Wei－zhong，CHENG Dao－mei，LENG Yan－bing*
(Department of public health，Chengdu Medical College，Chengdu 610083，China)

Objective:To optimize ethanol extraction of proanthocyanidins from longan seed.Methods:A Box－Behnken design in response surface analysis was used to optimization of ethanol extraction of proanthocyanidins from longan seed.Results:Ethanol concentration，ratio of raw material to solvent(W/V)and temperature were selected as experimental factors.The optional conditions of ethanol extraction technology were as follows:ethanol concentration was 40%，ratio of raw material to solvent was 1∶23，temperature was 39℃.The mathematical model was Y=1.15+0.034A+0.094B+0.004C－0.036AB+0.044AC－0.11BC－0.24A2－0.23B2－0.087C2.The predicted values was 1.16%.The measured value of proanthocyanidins yield from longan seed was 1.12%.Conclusion:The obtained model was credible and could be used for actual prediction.

longan seed，proanthocyanidins，response surface analysis

TS255.1

B

1002－0306(2012)08－0305－05

原花青素(proanthocyanidins，PC)是植物中广泛存在的一大类多酚化合物的总称，是由黄烷－3－醇缩合而成的聚合物，其中二聚体分布较广，研究较多。研究发现，植物中提取的原花青素具有很强的抗氧化和清除自由基能力［1］，诱导癌细胞凋亡［2－3］、抗炎和改善实验小鼠肥胖［4］等作用。龙眼亦称桂圆(Dimocarpus longgana Lour)，无患子科龙眼属植物，我国龙眼资源丰富，但龙眼核多作为食品加工的废弃物。目前，已有研究发现龙眼核提取物能抑制结肠癌细胞生长、诱导癌细胞凋亡［5］，具有清除自由基［6］，对实验小鼠有抗疲劳［7］等作用。响应面分析在提取条件分析中具有实验次数少、周期短、求得的回归方程精度高等优点［8］，因此本文以龙眼核为原材料，运用响应面优化法探讨龙眼核原花青素提取的最优条件，为其开发应用和深入研究打下基础。

2011－07－06 *通讯联系人

彭晓莉:(1979－)，女，硕士研究生，讲师，研究方向:营养与食品卫生。