细茎石斛中抗氧化的有效成分研究

王珏 王铁杰 殷果 王淑红 鲁艺 李晓帆

细茎石斛 Dendrobium moniliforme(Linn.).sw.为兰科石仙桃属植物，分布于我国的四川、湖南、广西等地。其全草或假鳞茎可以入药，具有清热利湿、散风止痛之功效，在民间用于治疗消化不良、痈疮肿毒及风湿疼痛等疾病［1］。目前从石仙桃中分离得到的主要为三萜类成分［2］。在初步的活性筛选过程中，细茎石斛全草60%乙醇提取物显示了出较好的抑制脂多糖(LPS)和干扰素-γ(IFN-γ)诱导的大鼠巨噬细胞(RAW264.7)一氧化氮(NO)生成的活性，即在终浓度为30μg/ml时抑制率为78.9%，且无细胞毒作用。因此笔者对其化学成分进行了研究，从细茎石斛干燥全草60%乙醇提取物中分离得到了6个化合物，根据理化常数和光谱分析鉴定其结构，分别为分别为 4，4’-二羟基-3，3’，5-三甲氧基-，’-二羰基二苯乙烯(1)，4，4'-二羟基-3，3'，5，α'-四甲氧基二苯乙烯(2)，4，4'，α'-三羟基-3，3'，5-三甲氧基二苯乙烯(3)，反式-3，5-二羟基-5-甲氧基二苯乙烯(4)，3，7-二羟基-2，4-二甲氧基菲(5)，毛兰菲(6)，化合物1首次从该植物中分离得有效活性成分。利用体外测定大鼠巨噬细胞NO生成量的活性筛选方法测定了6化合物的活性，其中化合物2和3具有很好的抑制大鼠巨噬细胞NO生成的作用，化合物3，5和6有强于白藜芦醇和芦丁的DPPH自由基捕捉削去作用。

1 仪器与材料

紫外光谱用岛津UV2401PC型紫外可见分光光度计测定(甲醇);红外光谱用岛津FT/IR-8400型傅立叶变换红外光谱仪测定(KBr);HR-ESI-MS和ESI-MS分别用Micromass Q-TOF型和Bruker Esquire 2000型质谱仪测定;核磁共振光谱用Bruker Avance 400型核磁共振波谱仪测定，TMS为内标。薄层层析用硅胶G和色谱用硅胶(200-300目)为青岛海洋化工厂生产。

2 提取与分离

细茎石斛全草2.3kg，60%乙醇回流提取2次，每次2小时，减压回收乙醇得浸膏(270 g，11.7%)。将浸膏用水(3.0 L)分散，依次用石油醚(3.0 L×3)、乙酸乙酯(3.0 L×3)和正丁醇(3.0 L×3)进行萃取。石油醚部分(45.0 g)经过硅胶柱色谱，环己烷-乙酸乙酯梯度洗脱，得到13个部份。Fr.10(10 g)经 Sephadex LH-20 柱色谱，甲醇-水(60∶40)为洗脱剂，然后经ODS中低压柱色谱，以甲醇-水(50∶50，70∶70)洗脱，再经制备 HPLC［甲醇-水(47∶53)，10 ml/min，275 nm］纯化得到化合物 4(11.4 mg)，2(50.6 mg)和6(14.4 mg)。Fr.7-4 经 ODS 柱色谱，甲醇-水(40∶60，50∶50)洗脱，再经制备 HPLC［甲醇-水(38∶62)，10 ml/min，220 nm］纯化得到化合物5(17.4 mg);Fr.7-5经ODS柱色谱，甲醇-水(40∶60，50∶50)洗脱，再经制备 HPLC［甲醇-水(42∶58)，10 ml/min，220 nm］纯化得到化合物1(6.8 mg)，3(5.8 mg)。

3 抑制大鼠巨噬细胞NO生成的活性测试

取大鼠巨噬细胞样细胞系(RAW 264.7)细胞，以1.2×106个/ml的浓度，每孔 200μL接种在 96孔板(SumitomoBakelite，#8096R，Tokyo)中，在 37°C 下培养 2 h。然后将0.4 μl供试品(终浓度:3 μM，10μM，30μM，100μM)与 2 μL LPS(终浓度:100ng/ml)和2 μL INF-γ(终浓度:0.33 ng/ml)一同加入到细胞液中，共同在37°C下培养16 h，之后将细胞液迅速冷却。取上清液按照每孔100μL置于新的96孔板中，接着在每孔中加入50μL的Griess试剂。室温下放置10 min后，用酶标仪在550nm测定反应产物的吸收值，并扣除在630nm测定的背景吸收值。在同一块96孔板中，同时加入NaNOa的标准溶液用以计算NO-2浓度的标准曲线，以未加细胞、LPS、INF-γ和供试品的细胞培养液作为空白，以未加样品的细胞液作为阴性对照，以白藜芦醇(resveratrol)作为阳性对照。用MTT法测试细胞毒作用。NO抑制率=［(A阴性对照组-A实验组)/A阴性对照组)］×100%。(实验结果见表1)

表1 化合物体外抑制大鼠巨噬细胞NO生成的试验及DPPH自由基清除作用结果

4 DPPH自由基清除作用测试

参照文献实验方法并加以改进，将不同浓度的供试品溶液100μL和2×10-4M DPPH·溶液100μL加入96孔板各孔中，同时以不加DPPH·的供试品溶液各浓度作为对照以消除供试品本身颜色对测试结果的干扰，并设DPPH·阴性对照(以100μL无水乙醇代替供试品)，每组平行设4个复孔。将96孔板放入酶标仪中，震荡1 min，并于此条件下保存(室温、避光)，30 min后测试其在517 nm处的吸光度OD值，按如下公式计算供试品的自由基清除率。自由基清除率=［ODDPPH·阴性对照组-(OD实验组-OD实验组乙醇对值)］/ODDPPH·阴性对照组×100%(实验结果见表1)

5 结论

随着对自由基研究的逐渐深入，人们认识到自由基与衰老、癌症、心脑血管疾病和炎症等的发生与发展密切相关一氧化氮(NO)和DPPH都是自由基及抗氧化活性的常用试剂。NO及DPPH参与许多生理和病理过程，巨噬细胞在IL-1、IL-2、TNF、IFN等细胞因子和内毒素(如LPS)的诱导下可以产生大量的NO，同时NO上调又可以使巨噬细胞释放炎症性细胞因子，如TNF-α、IL-la和rIFN等。这些因子对机体既起到介导炎症的作用，又起到细胞生长分化的调节作用。巨噬细胞在细胞内、外环境变化时可通过NO产生免疫保护、免疫损伤和免疫调节作用。

本实验利用体外抑制大鼠巨噬细胞NO生成的活性测试体系，对从细茎石斛中分离得到的6个化合物进行了活性测定，结果表明化合物1、2和3具有很好的NO生成的抑制作用，活性好、于阳性对照白藜芦醇和芦丁，并且没有细胞毒作用。化合物3，5和6具有很好的DPPH自由基捕捉削去能力，化合物5和6活性结果好于阳性对照白藜芦醇和芦丁一倍左右。该结果提示细茎石斛中的抗炎抗氧化活性成分可能为苄类及其衍生化合物。

［1］Jiangsu New Medical College.Dictionary of Chinese Materia Medica(中药大词典).Shanghai:Shanghai Scientific and Technical Publishers，1986.

［2］Ma X M，Li M F，Zhang Q R.Chemical constitutes of Yunnan Pholidota(Pholidota yunnnanesis).Zhongcaoyao(中草药)，1995，26(2):59-61.