双核镍配合物［Ni2(Htda)2(H2O)6］·4H2O与DNA作用和细胞凋亡研究

武光磊， 湛 琳， 徐 进， 高恩军

(沈阳化工大学配位化学研究室沈阳市无机分子基材料化学(国际)重点实验室，辽宁沈阳 110142)

DNA是生物体中重要的一类生物大分子，对于生命遗传密码的翻译、转录、复制起着非常重要的作用.顺铂(cis-DDP)，奥沙利铂、卡铂等铂配合物作为广谱抗肿瘤药物在临床上的广泛应用，促使很多研究者研究了大量金属配合物与DNA的反应，探讨金属配合物与DNA作用的反应机理，进而研究金属配合物的分子结构及与DNA反应机理的关系，为筛选出新的生物学研究工具，设计合成出具有应用前景的低毒、高效、抗菌、抗肿瘤药物提供一定的科学研究基础及理论根据［1-5］.

1，2，3-三氮唑-4，5-二羧酸存在众多配位原子，可分步失去质子，表现出灵活多变的配位方式.配体本身具有较好的水溶性，其氮氧原子易分别与亲氮和亲氧离子配位，其2-位氮原子还可提供氢键作用或配位作用.此外，基于Htda有机分子配体配合物性质的报道目前还很少，本文参照文献［6］合成双核镍(Ⅱ)金属配合物［Ni2(Htda)2(H2O)6］·4H2O.Barton 等人［7］提出［Ru(phen)3］2+与DNA作用时有插入和静电作用2 种模式，Norden 等人［7］则认为［Ru(phen)3］2+与DNA 作用时只存在静电作用1种模式［1，6］.金属配合物与DNA之间的作用机理与模式一直存在一定的争议，针对此问题用紫外分光光度法、荧光分光光度法和凝胶电泳法对双核镍(Ⅱ)金属配合物［Ni2(Htda)2(H2O)6］·4H2O与DNA之间的相互作用进行研究，研究结果显示此配合物主要以静电作用与DNA结合，但也存在一定的插入作用.此外，对配合物引发细胞凋亡的能力与顺铂做比较，结果显示细胞凋亡效果明显区别于顺铂.

1 实验部分

1.1 仪器

PXJ21C数字显示离子计，配丹麦2401B型Ag/AgCl复合电极;Nicolet IR2470型红外光谱仪，KBr压片;Bruker CCD晶体衍射仪;UV-240岛津近红外可见紫外分光光度计，日本岛津;PerkinElmer荧光分光光度计，美国铂金埃尔默;培清凝胶成像分析系统，上海培清.

1.2 试剂

小牛胸腺DNA，国药集团产品;Hela细胞DNA，本实验室自己提取，相对分子质量大于30 000，用前作进一步稀释处理，纯度以260 nm处吸光度与280 nm处吸光度的比值检测(A260/A280=1.9);其他试剂均为分析纯.

1.3 配合物的合成

按文献［7］方法合成双核镍(Ⅱ)金属配合物［Ni2(Htda)2(H2O)6］·4H2O，元素分析、单晶衍射和红外吸收光谱与文献［7］报道一致.

1.4 实验过程

研究配合物与DNA的作用时，样品均溶解在含5 mmol·L-1Tris(三羟甲基氨基甲烷)和50 mmol·L-1NaCl的二次蒸馏水缓冲液(pH=7.10)中，小牛胸腺DNA和Hela细胞DNA的浓度以ε260=6 600 L·mol-1·cm-1确定.

2 结果与讨论

2.1 配合物的结构

从图1可看出，2个金属Ni(Ⅱ)原子分别与4个氧原子(3个来自水分子，1个来自Htda配体)和2个氮原子(分别来自2个Htda配体)配位螯合成2个五元环和1个六元环的近平面稳定结构.在配合物的单元分子中，存在4个游离水分子，为维系空间结构稳定性氢键的形成提供基石.在Ni(1)和Ni(2)两个镍原子形成的配位键中，Ni(1)—N(3)和Ni(1)—N(5)的键长分别 为 0.206 67 nm 和 0.205 03 nm，Ni(2)—N(2)和 Ni(2)—N(4)的键长分别为0.202 95 nm和0.206 19 nm，N(5)—Ni(1)—N(3)和N(2)—Ni(2)—N(4)的键角分别为96.000°和96.477°，二者都存在略微的差异，同样Ni(1)和Ni(2)与氧原子之间的配位也存在略微的差别，但整个配合物近乎是一个对称结构.水分子的体积忽略，则可看做一个大五元环六元环交错的平面矩形.配合物的部分晶体数据如下:空间群:C2/c;F(000):2 504;衍射映像/独特性:11 954/3 762［R(int)=0.029 2］;完整性，%:99.6;拟合度 F2:1.058;数据/限制/参数:3 762/4/360;R最终指数(I＞2σ(I)):R1=0.317，wR2=0.074 9;R指数(所有数据):R1=0.039 9，wR2=0.080 4.

图1 配合物单元结构(氢原子被省略)Fig.1 Complexes with structural(H atoms are omitted)

2.2 紫外光谱法研究双核镍(Ⅱ)配合物与小牛胸腺DNA作用

紫外光谱法是很多种检测配合物与DNA作用的方法之一［8］.含有碱基生色团的双螺旋结构DNA分子，其UV/Vis吸收光谱在260 nm附近有一强吸收峰，当小分子与核酸结合后，对核酸或小分子吸收峰的吸收光谱都会引起变化，可根据相互作用前后DNA或其他分子的吸收谱带的变化对金属配合物与作用模式进行判断.对于DNA的吸收光谱:如导致构象变化，则产生减色效应和红移现象，且作用越强减色效应越明显;如导致DNA双螺旋结构的破坏，则产生增色效应［9］.对于金属配合物等小分子的特征吸收谱带，当金属配合物嵌插到DNA碱基对中，即发生插入作用时，将会发生减色效应，这是因为DNA碱基对与插入配体间发生π电子堆积，使后者的π*空轨道上也有一定的电子填充，从而使电子从金属转移到配体上跃迁(MLCT跃迁)的几率减少.减色效应的强弱，能够反映插入能力的大小，插入能力越强，减色效应越强.与DNA发生插入作用后的配合物，插入配体与DNA碱基对间发生π电子堆积后，配合物的配体共轭性加强，产生红移现象，红移程度反映出插入能力的大小.插入能力强的配合物，红移较大，插入能力弱的配合物，红移较小［10］.

配合物与小牛胸腺DNA作用的紫外光谱图见图2.配合物在波长为210～360 nm的紫外范围内有明显的特征吸收峰，为芳香氮碱配体内的n-π*电子跃迁形成，DNA的掺入使配合物各特征吸收峰在波长发生明显的减色效应，DNA浓度越大，趋势越明显，并有等色点生成.说明配合物与DNA之间建立了新的平衡关系，生成新的化合物物种.配合物以静电方式与DNA螺旋碱基对结合，发生孤对电子静电吸引作用，配体上孤对电子数目减少，使n-π*跃迁几率减小，产生减色效应.

图2 配合物与DNA作用的紫外光谱图Fig.2 UV spectra of complex with DNA

2.3 荧光光谱法研究双核镍(Ⅱ)配合物与小牛胸腺DNA的作用

溴化乙锭(EB)具有共轭芳香环的平面结构，能专一平行地嵌入DNA双链的配对碱基之间.在水溶液中，其本身荧光极弱，而DNA分子几乎没有荧光.但当溴化乙锭插入双链DNA分子之后，溴化乙锭分子借助其与碱基之间的堆积作用而能平行地“固定”在DNA分子内部，从而使溴化乙锭分子平面刚性增加，碰撞淬灭减小，发出的荧光强度大概提高了10倍［11］.溴化乙锭不能插入单链DNA中，而只能插入双螺旋DNA分子中，因为它与DNA的插入作用是通过碱基间堆积而产生的.因而溴化乙锭是一种能与DNA双链发生专一插入作用，且选择性好，灵敏度高的荧光探针.

如果配合物是以插入方式与DNA结合，那么就能与DNA发生类似EB的插入作用，从而竞争EB与DNA结合的位点，释放出EB，使EB/DNA复合体系荧光减弱:M+EB·DNA=M·DNA+EB.根据经典斯特恩-沃尔默(Stern-Volmer)方程［12］:I0/I=1+Ksq·r. 其中:I和 I0分别代表复合物(配合物/EB/DNA)中存在和不存在配合物时的荧光强度;r为复合物中配合物与小牛胸腺DNA的浓度比;Ksq表示斯特恩-沃尔默(Stern-Volmer)淬灭常数，其可以定量描述配合物与DNA的作用强弱.从Ksq值的大小就可以定量地比较几个化合物在相同条件下与DNA作用的强弱程度，Ksq值越大，作用强度越大，结合能力越强.

配合物与DNA作用的荧光光谱图见图3.

图3 配合物对DNA-EB体系荧光强度的影响Fig.3 Emission spectrum of EB bound to DNA in the presence of the complex

从图3可以看出，随着配合物浓度的增加，DNA-EB复合物的体系荧光强度逐渐减弱，且发生了一定程度的淬灭，并且浓度越大，荧光猝灭逐渐趋于平衡.当配合物的浓度逐渐增加到最大时，配合物把DNA-EB复合物体系的荧光强度约由135淬灭到115，下降幅度为20.由斯特恩-沃尔默(Stern-Volmer)方程作图，见图4.配合物的斯特恩-沃尔默淬灭常数值(Ksq)为0.053 0.这一现象说明配合物与DNA发生了一定程度的插入作用，但作用微弱，说明配合物分子与DNA结合主要以静电模式，同时存在一定的插入作用.

图4 配合物对DNA-EB体系作用的stern图Fig.4 Interaction with the DNA-EB system

2.4 凝胶电泳技术研究双核镍(Ⅱ)配合物对Hela细胞DNA的切割作用

在外电场作用下，带电荷物质会向着与其所带电荷电性相反的电极移动.DNA中存有亲水性的磷酸基团，在高于其等电点的缓冲溶液中带负电荷，从而使DNA在电场中通过凝胶介质向正极泳动.影响DNA在凝胶介质中移动的因素主要有电荷效应、凝胶介质的分子筛效应.在电荷相同的条件下，凝胶介质的分子筛效应至关重要，其与相对分子质量大小及构型有关;相对分子质量越小，空间构型产生的空间位阻越小，迁移位置就越靠前，而DNA带间的距离也就越大.当共价闭环型DNA的一条链上出现一个缺口时，超螺旋结构解开，形成开环型结构;若2条链在同一位置发生断裂时，则成为线形分子.某些能插入DNA双螺旋碱基对之间的试剂如EB、放线菌素D可以改变DNA的超螺旋状态，使负超螺旋减少，以至完全松开形成单链开环结构，甚至形成正超螺旋，进而能通过凝胶电泳实验表现出来［13-14］.基于上述原理及前面的荧光法实验结果，以凝胶电泳实验来研究配合物对DNA的切割作用.

配合物的凝胶电泳实验结果见图5.在图5中，Lane 0是纯的 DNA，Lane 1～4分别为10 μmol/L、5 μmol/L、2.5 μmol/L、1.25 μmol/L 的配合物与DNA在有氧条件下反应2 h的电泳图像.随着配合物浓度的增大，配合物使质粒DNA的超螺旋带(FormⅠ)和开环带(FormⅡ)没有明显增多，而且无线性带(FormⅢ)出现.此结果可以看出，配合物对DNA的切割能力比较微弱，这个结果与上述的荧光淬灭实验中的趋势相一致，原因很有可能是 1，2，3-三氮唑-4，5-二羧酸是一个富电子的小平面结构配体，配合物与DNA结合模式主要以静电作用为主，插入作用相对较弱.

图5 配合物对Hela DNA切割作用的电泳图Fig.5 Cleavage of Hela DNA in the presence of complex

2.5 双核镍(Ⅱ)配合物对Hela细胞的形态学影响研究

细胞凋亡［15-17］，又称细胞程序性死亡，是指细胞在一定的生理和病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程.细胞凋亡不同于细胞坏死，是程序性死亡过程的一种主要形式，强调的是形态学上的改变.将处理好的爬片放在光学显微镜下进行观察、拍照.从图6(a)可以看出，正常Hela细胞在染色后呈不规则的多角形，细胞与细胞间连接紧密，细胞核完整，染色体均匀淡蓝色，属正常生长状态.图6(b)是顺铂作用下Hela细胞凋亡的形态，细胞间隙增大，细胞变圆，变小，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有出芽现象，并伴有凋亡小体.配合物作用过的细胞也发生了类似的变化(见图6(c))，可明显地观察到凋亡的形态学特征.由此看出，Hela细胞在配合物的作用下发生了一定程度上的凋亡，但引起细胞凋亡的作用效果明显没有顺铂强烈.

图6 Hela细胞培养48 h后经染色在显微镜下的形态Fig.6 The shape of the staining of HeLa cells under the microscope after 48 h

3 结论

经过对配合物与DNA作用的研究，表明双核镍(Ⅱ)配合物［Ni2(Htda)2(H2O)6］·4H2O对DNA具有一定的结合能力，结合的作用模式主要以静电作用为主，同时存在插入作用，是二者共同作用的结果.通过配合物对细胞形态学影响的研究，发现此配合物可以引起细胞一定程度上的程序性死亡，但细胞凋亡效果明显没有顺铂强烈.

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