正交法研究云南粗根荨麻多糖的提取条件

李仲昆 王崇静 王珩 尹为民

正交法研究云南粗根荨麻多糖的提取条件

李仲昆 王崇静 王珩 尹为民

目的研究提取和测定云南粗根荨麻多糖的方法。方法用正交法对云南粗根荨麻多糖的提取条件进行研究，用硫酸-苯酚比色法对多糖的含量进行测定。结果粗根荨麻水提物、粗多糖、精制多糖的多糖含量分别为12.3%、30.4%、42.7%。结论提取和测定粗根荨麻多糖的方法简便易行，稳定可靠。

云南粗根荨麻;正交设计;多糖

荨麻属(Urtica L.)植物全世界约35种，主要分布于北半球温带和亚热带，中国约有23种。荨麻、宽叶荨麻在我国广泛分布，齿叶荨麻、新疆荨麻、甘肃荨麻、粗根荨麻为我国特有品种，而粗根荨麻主分布于云南。荨麻属多种植物均可药用，多以全草入药，少数地方药用根及根茎(称荨麻根)，有祛风通络、活血止痛、平肝定惊、消积通便、解毒等功效［1］。

国外对大荨麻和异株荨麻进行了较系统的研究，发现其可以用来治疗前列腺增生、风湿性关节炎、过敏性鼻炎、皮肤病、高血压、心脏病、糖尿病，并且具有抗病毒及免疫调节活性。

我国目前尚无成型产品，虽然有相关研究［2-4］，但是对云南特有的粗根荨麻少见研究，因此有必要加强研究。

1 仪器与材料

UV-2401型紫外分光光度计(日本岛津);FA-2004型电子天平(上海精密科学仪器有限公司);离心机;旋涡振荡仪;超声振荡仪;HH.S型电热恒温水浴锅(江苏省医疗器械厂)。石油醚，乙酸乙酯，鞣酸，无水乙醇，苯酚，浓硫酸均为分析纯。D-无水葡萄糖(中国生物制品检定所，0833-9501)。

2 方法与结果

2.1 正交设计确定粗根荨麻叶提取工艺 根据相关文献资料，以加水量，煮沸时间，浸泡时间为实验因素，每个因素分为3个水平，见表1。(每份样品的粗根荨麻叶重量为2 g)

表1 因素水平表

根据表1选择L9(34)正交表实施实验，结果见表2，3。

表2 正交实验与结果L9(34)

表3 方差分析表

根据方差分析的结果，B因素各水平间都有显著性差异，各因素对实验指标影响的大小，可用该因素各水平的极差R表示，这是由于正交表具有搭配均匀的特性，A列上的K1，K2，K3的差异可认为主要由A列上的不同水平引起的;同样，B列，C列上的差异也可认为主要是由B列，C列上的不同水平引起的。因此，某因素的极差大，就表明该因素对实验的指标影响大。根据分析的结果，因素的主次顺序为B＞C＞A。条件为B3A1C1。

2.1.1 粗根荨麻叶提取 以加水量1000 m l，煮沸时间1 h，不浸泡，将100 g粗根荨麻叶进行提取，将提取液浓缩干燥后得粗根荨麻干品15.6 g，收率为15.6%。

2.1.2 正交设计确定粗根荨麻杆提取工艺 以加水量，煮沸时间，浸泡时间为实验因素，每个因素分为3个水平，见表4。(每份样品的粗根荨麻杆重量为2 g)

表4 因素水平表

根据表1选择L9(34)正交表实施实验，结果见表5，6。

表5 正交实验与结果L9(34)

表6 方差分析表

根据方差分析的结果，B因素各水平间都有显著性差异.各因素对实验指标影响的大小，可用该因素各水平的极差R表示.这是由于正交表具有搭配均匀的特性，A列上的K1，K2，K3的差异可认为主要由A列上的不同水平引起的;同样，B列，C列上的差异也可认为主要是由B列，C列上的不同水平引起的。因此，某因素的极差大，就表明该因素对实验的指标影响大。根据分析的结果，因素的主次顺序为B＞A＞C。条件为B3A1C1。

2.2 2粗根荨麻杆提取率 以加水量1000 ml，煮沸时间1 h，不浸泡，将100 g粗根荨麻杆进行提取，将提取液浓缩干燥后得粗根荨麻干品9.5 g，收率为9.5%。

2.3 粗根荨麻提取液的含量测定

2.3.1 标准对照品溶液的制备 精密称取经105℃干燥至恒重的无水葡萄糖30 mg，置50 ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1 ml中含无水葡萄糖0.6 mg)。

2.3.2 标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 ml，分别置25 ml量瓶中，各加水至刻度，摇匀。分别精密量取上述液1.0 ml，置具塞试管中，各加4%苯酚溶液1.0ml，混匀，迅速加入硫酸7.0ml，摇匀，置75℃水浴中保温30 min，取出后冷却至室温，以相应试剂为空白。照分光光度法(附录VB)，在490nm的波长处测定吸收度，经计算得标准曲线C=15.169311A-0.06653。

经计算，r=0.999123，线性关系良好。

2.3.3 粗根荨麻提取液的含量测定 称取粗根荨麻粉末2.0 g，按照表2的条件进行试验，煮沸后的样品加水到原始重量后，将上层液倒入10 ml试管，离心5.0 min(3000r/min)，取上清夜3.0 ml加3.0 ml石油醚，旋涡振荡1 min，超声10 min，离心5 min，取下层液2.0 ml加入3.0 m l乙酸乙酯，旋涡振荡1 min，超声10 min，离心5 min。取下层液1.0 m l加1%鞣酸5.0 ml，水浴煮沸5 min，加入活性炭适量，煮沸5 min，离心，取上清液1.0 ml加入95%乙醇6.0 ml，于箱冷藏20 h，离心，弃去上清液，残渣用95%乙醇8 m l洗涤，离心，弃去上清液，挥干乙醇。残渣加5.0 ml蒸馏水，振荡溶解，取1.0 ml加入4%苯酚1.0 ml，混匀后，缓慢加入7.0 ml浓硫酸，振荡，超声10 min，放入75℃水浴中加热30 min，冷却至室温后在490nm处测定吸收度。将A值代入回归方程计算，求出提取物含多糖的量。

2.4 粗根荨麻水提物、粗多糖、精制多糖的制备 水提物的制备方法为将干燥后的粗根荨麻杆、叶粉碎后，经过2次水提取，合并提取液，干燥后即得，一般可以得到10%的干燥品，即1 g相当于10 g生药，测定后含多糖为12.3%。

粗多糖的制备方法为，将干燥的水提物25 g，加水70 ml溶解，加95%乙醇350 ml，搅拌，倾去上层液体。沉淀加水50 ml溶解，加95%乙醇250 ml，搅拌，倾去上层液体，沉淀干燥后即得。可得9 g粗多糖，即1 g相当于28 g生药，测定后含多糖为30.4%。

精制多糖的制备方法为，将干燥的水提物25 g，加水70 ml溶解，加95%乙醇350 ml，搅拌，倾去上层液体。沉淀加水50 ml溶解，加95%乙醇250 m l，搅拌，倾去上层液体，此操作再重复2次，沉淀干燥后即得。可得6.5 g精制多糖，即1 g相当于38 g生药，测定后含多糖为42.7%。

［1］李蓉，秦民坚，余国奠.荨麻属药用植物研究概况及其开发价值.中国野生植物资源，2003，21(1):24-26.

［2］王梦月，李外，李晓波.荨麻水溶性化学成分研究.中国药学杂志，2005，40(24):1853-1855.

［3］刘悦秋，孙向阳.异株荨麻的活性成分及开发利用.国外医学.中医中药分册，2005，27(3):144-148.

［4］王月梦，卫莹芳，史炎.荨麻多糖药理作用研究.中药材，2001，24(9):666-667.

Orthogonal design study the extraction conditions of Yunnan Urtica Macrorrhiza Hand-Mazz polysaccharide

LIZhong-kun，WANGChong-jing，WANGHeng，et al.

Yan'an Hospital of Kunming，Yunnan Kunming 650051，China

ObjectiveTo study themethods of extraction and determination Yunnan Urtica Macrorrhiza Hand-Mazz polysaccharide.MethodsTo study the extraction conditions of Yunnan Urtica Macrorrhiza Hand-Mazz polysaccharidewith orthogonal design.The polysaccharide was determined by colourimetry with sulfuric acid-phenol as colourimetric resgent.ResultsYunnan Urtica Macrorrhiza Hand-Mazz aqueous extracts，polysaccharide，purification of the polysaccharide contents are respectively 12.3%，30.4%，42.7%.ConclusionExtraction and determination of Yunnan Urtica Macrorrhiza Hand-Mazz polysaccharidemethod is simple，stable and reliable.

Yunnan Urtica Macrorrhiza Hand-Mazz;Orthogonal design;Polysaccharide

云南省科技计划面上项目(项目编号:2008ZC147M)

650051 昆明市延安医院(李仲昆 王崇静 王珩);云南省第一人民医院(尹为民)

尹为民