扇贝性腺多糖提取物的抗氧化及免疫调节活性

宋荪阳，孙黎明,*，朱蓓薇，牛海玲，杨静峰

(1.大连工业大学食品学院，辽宁 大连 116034；2.国家贝类加工技术研究分中心，辽宁 大连 116034)

扇贝性腺多糖提取物的抗氧化及免疫调节活性

宋荪阳1,2，孙黎明1,2,*，朱蓓薇1,2，牛海玲1,2，杨静峰1,2

(1.大连工业大学食品学院，辽宁 大连 116034；2.国家贝类加工技术研究分中心，辽宁 大连 116034)

通过酶解法制备扇贝性腺多糖提取物(SGP)，研究其抗体外氧化及免疫调节活性。采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼DPPH体系反应、Fenton反应和还原反应测定SGP的抗氧化活性；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法测定SGP 对活性氧叔丁基脂氢过氧化物(tBOOH)致细胞氧化损伤及淋巴细胞增殖活性的调节作用；分光光度法测定SGP 对补体活性的影响。结果表明：SGP具有DPPH自由基清除能力(IC50=9.92mg/mL)和羟自由基清除能力(IC50=7.31mg/mL)及还原能力(AC20=7.74mg/mL)；0.2μg/mL的SGP可明显改善tBOOH致RAW264.7细胞的氧化损伤作用，还可显著提高脾淋巴细胞的增殖活性及补体经典途径活性。

扇贝性腺；多糖提取物；抗氧化；淋巴细胞增殖；补体

虾夷扇贝是一种重要的海珍品，其中闭壳肌为主要可食部分，而其他部分如裙边、内脏、性腺等大部分被丢弃。多糖是存在于贝类体内的一种活性物质[1-4]。近年来，研究报道表明从扇贝废弃物中提取的多糖具有广泛的生理活性。王长云等[5]从海湾扇贝边中提取出的氨基多糖具有抗凝血活性。殷红玲等[6]从扇贝内脏中提取多糖，具有羟自由基清除能力。金晓石等[7]从华贵栉孔扇贝全脏器中提取糖胺聚糖，能够显著抑制HeLa细胞的生长。目前，有关扇贝性腺多糖提取物的研究尚未见报道。

本实验以虾夷扇贝性腺为原料，制备扇贝性腺多糖提取物，并对其清除DPPH自由基、清除羟自由基、还原能力和对叔丁基脂氢过氧化物(tBOOH)致细胞氧化损伤的保护作用等抗氧化活性进行研究。同时探讨扇贝性腺多糖提取物对淋巴细胞增殖和补体活性的影响，以期为扇贝的深加工及扇贝功能食品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜虾夷扇贝，由大连獐子岛渔业集团股份有限公司提供。

胃蛋白酶 杭州中香化学有限公司；木瓜蛋白酶上海生工生物工程技术服务有限公司；碱性蛋白酶 北京东华强盛生物技术有限公司；中性蛋白酶 Sanland-chem International 公司；胰蛋白酶 美国Amresco公司；链霉蛋白酶 北京索莱宝科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LG-1.0型真空冷冻干燥机 沈阳航天新阳速冻设备制造有限公司；UV-2100紫外分光光度计 尤尼柯仪器有限公司；Bio-Rad 680酶标仪 美国Bio-Rad公司；倒置显微镜 日本奥林巴斯公司；CO2培养箱 日本三洋公司。

1.3 实验动物及供试细胞

昆明种小鼠，18～20g，雌性，由大连医科大学提供。

RAW264.7细胞(ATCCTIB-71) 上海细胞研究所；绵羊红细胞(SRBC) 大连医科大学。

1.4.4 对羟自由基的清除能力

1.4 方法

1.4.1 扇贝性腺多糖提取物的制备

从新鲜虾夷扇贝中取出性腺，清洗，经真空冷冻干燥机干燥48h，使其水分质量分数控制在8%(以100g干物质计)以下，粉碎，过20目筛，得扇贝性腺冻干粉，备用。

取扇贝性腺冻干粉，加入25倍体积水搅拌均匀，预煮20min，并超声30min。用6mol/L HCl溶液调pH值到2.0，加入质量分数2.5%的胃蛋白酶，37℃水浴2.5h，煮沸灭酶10min。冷却至室温后，用6mol/L NaOH溶液调pH值至中性，离心10min，取上清。加入3倍体积95%乙醇，醇沉1 2 h，取沉淀，水溶沉淀，离心、收集上清液，浓缩、冻干。

所得冻干样品再经碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶依次酶解，条件分别按表1进行。之后醇沉12h，离心收集上清，浓缩、冻干。

表1 蛋白酶的水解条件Table 1 Parameters for enzymatic hydrolysis

将上述酶解样品冻融离心后配成5g/100mL的样品溶液。按酶与蛋白质量比1:50的比例加入链霉蛋白酶，37℃水浴保温24h，之后醇沉12h，浓缩，透析，冻干，即得扇贝性腺多糖提取物(scallop gonad polysaccharide，SGP)。

1.4.2 SGP组分测定

多糖测定：采用苯酚-硫酸法；蛋白质测定：采用Folin-酚法；硫酸根测定：采用明胶比浊；氨基己糖、氨基半乳糖测定：采用氨基比色法；糖醛酸测定：采用比色法[8]。1.4.3 对DPPH自由基的清除能力

在0.1mL不同质量浓度的SGP溶液中加入0.2mL 0.1mmol/L pH 6.0磷酸盐缓冲液和0.2mL 0.2mmol/L DPPH溶液(用9 5%乙醇配制)，混匀后在室温下避光反应30min。于波长517nm处测定吸光度A1。同时用95%乙醇代替DPPH溶液测定吸光度A2，用去离子水代替样品测定吸光度A0，VC为阳性对照[9]。

按顺序分别取0.25mL 0.75mmol/L的邻菲罗啉，0.25mL 0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)，0.25mL SGP溶液，充分混匀后，再加入0.25mL FeSO4(0.75mmol/L)和 0.1mL H2O2(0.1mL/L)启动反应，于37℃水浴保温60min，在波长536nm处测OD值。空白组以等体积的去离子水代替SGP，对照组以等体积的去离子水代替SGP和H2O2，用VC作阳性对照[9]。

1.4.5 还原能力测定

取0.2mL不同质量浓度SGP溶液，加入0.1mol/L pH 6.6的磷酸缓冲液0.2mL和1g/100mL铁氰化钾溶液0.1mL，混匀，50℃保温20min，再加入10g/100mL三氯乙酸溶液0.1mL，振荡混匀，4000r/min离心10min。取上清液0.25mL，加入0.25mL去离子水和0.05mL 0.1% FeCl3溶液，静置10min后于波长700nm处比色。用去离子水做空白对照，VC为阳性对照[9]。

1.4.6 对tBOOH致细胞氧化损伤的保护作用

取对数生长期的RAW264.7细胞，调节细胞密度为5×104个/mL。96孔培养板中每孔加入180μL细胞，再加20μL SGP溶液(终质量浓度分别为0.2、1、5μg/mL)；正常对照组和tBOOH对照组加相应体积的生理盐水；每组5个平行；于37℃，5% CO2饱和湿度的培养箱中培养24h后，除正常对照组，其他每组各孔再加入5μL tBOOH，终浓度为8×10-5mol/L；继续培养2h后，每孔加入20μL 5mg/mL MTT，继续孵育4h。离心，弃上清，加入150μL DMSO溶解甲瓒。用酶标仪于波长570nm处测OD值。

1.4.7 对淋巴细胞增殖活性的影响

无菌制备小鼠脾脏细胞。在96孔细胞培养板内，每孔添加180μL脾细胞悬液，细胞数为5×106个/mL，再加入10μL的SGP溶液(终质量浓度分别为0.2、1、5μg/mL)，于37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养24h。生理盐水为对照。MTT比色法测定同1.4.6节。

1.4.8 对补体激活经典途径活性的影响

取脱纤维绵羊红细胞(SRBC)用缓冲液GGVB(0.141mol/L NaCl、0.5mmol/L MgCl2、0.15mmol/L CaCl2、1.8mmol/L 巴比妥钠、0.1%明胶，pH7.4)离心洗3次，2000r/min，离心10min。制备体积分数2%的SRBC样品，加入等体积1:4000稀释的溶血素，混匀后置37℃水浴30min，即为致敏的SRBC。于10μL SGP溶液中加入200μL补体(人血清，1:25稀释)和200μL GGVB，37℃水浴30min，加入100μL致敏SRBC，37℃水浴30min，4000r/min离心10min，于波长405nm处测上清液OD值。用10μL GGVB代替样品作为空白对照。

1.4.9 统计学方法

2 结果与分析

2.1 SGP的制备及其组合分析

表2 SGP的组分分析Table 2 Component analysis of SGP

经过多种蛋白酶处理及醇沉后制备得到SGP，其各组分如表2所示。多糖、氨基己糖和氨基半乳糖质量分数分别为50.10%、12.83%和3.73%，构成SGP的糖链部分。此外，SGP还含有一定量的蛋白质、硫酸根和糖醛酸，说明SGP是一种氨基硫酸酯多糖-蛋白复合物。

2.2 SGP的自由基清除能力及还原能力

在SGP质量浓度2.5～20mg/mL范围内，对DPPH自由基的清除率从22.9%升至86.3%，清除能力与浓度具有明显的效应-剂量关系，IC50值为9.92mg/mL。同时，还原能力也随SGP质量浓度增大逐渐增大(表3)，根据线性回归方程计算得出AC20值(吸光度为0.2时的样品质量浓度)为7.74mg/mL。质量浓度为2～10mg/mL的 SGP对羟自由基的清除率从15.9%升至65.4%，IC50值为7.31mg/mL(图 1)。

表3 SGP对DPPH自由基的清除能力及还原能力(±s，n=10)Table 3 Scavenging effect of SGP on DPPH free radicals and its reducing power (x ± s，n=10)

表3 SGP对DPPH自由基的清除能力及还原能力(±s，n=10)Table 3 Scavenging effect of SGP on DPPH free radicals and its reducing power (x ± s，n=10)

SGP质量浓度/(mg/mL)DPPH自由基清除能力/% 还原能力(OD700nm)2.5 22.9±2.1 0.073±0.0027 5 31.1±2.9 0.141±0.0037 10 51.9±2.3 0.255±0.0055 15 68.4±4.1 0.375±0.0046 20 86.3±3.8 0.469±0.0046

图1 SGP对羟自由基清除能力的影响(±s，n=10)Fig.1 Scavenging effect of SGP on hydroxyl free radicals± s，n=10)

2.3 SGP对RAW264.7细胞氧化损伤的保护作用

表4 SGP对tBOOH导致的氧化损伤细胞的保护作用(± s，n=10)Table 4 Protective effect of SGP on tBOOH-induced cell oxidation(± s，n=10)

表4 SGP对tBOOH导致的氧化损伤细胞的保护作用(± s，n=10)Table 4 Protective effect of SGP on tBOOH-induced cell oxidation(± s，n=10)

注：##.与正常对照组比较，有极显著差异(P＜0.01)；*.与tBOOH组比较，有显著性差异(P＜0.05)；**.与tBOOH组比较，有极显著性差异(P＜0.01)。

组别 对氧化损伤的保护作用(OD570nm)正常对照组 0.981±0.015 tBOOH对照组 0.654±0.010##0.2 0.669±0.003*SGP质量浓度/(μg/mL) 1 0.712±0.002**5 0.735±0.010**

由表4可见，与正常对照组比较，tBOOH的加入可导致RAW264.7细胞活力明显下降，说明tBOOH可造成细胞严重的氧化损伤。加入终质量浓度为0.2、1、5μg/mL 的SGP后，RAW264.7细胞的活力均得到显著提高。结果表明，SGP能够提高细胞的抗氧化能力，从而抵抗氧化剂tBOOH的损伤作用。

2.4 SGP对淋巴细胞增殖活性的影响

由表5可见，当SGP质量浓度分别为0.2、1、5μg/mL时，随着其质量浓度的增大，对淋巴细胞增殖的促进作用也逐渐增强，且作用非常显著。

表5 SGP的免疫活性(±s，n=10)Table 5 Immune activity of SGP (x ± s，n=10)

表5 SGP的免疫活性(±s，n=10)Table 5 Immune activity of SGP (x ± s，n=10)

注：*.与空白对照组比较，有显著性差异(P＜0.05)；**.与空白对照组比较，有极显著性差异(P＜0.01)。

组别 淋巴细胞增殖 淋巴细胞 补体活性 补体激活性(OD570nm) 增殖指数 (OD405nm) 活率/%空白对照组 0.942±0.012 0.859±0.025 SGP 0.2 0.979±0.009* 1.04±0.005 0.933±0.025** 8.64±2.1质量浓度/ 1 1.04±0.028** 1.10±0.028 1.067±0.021** 24.12±0.5(μg/mL) 5 1.13±0.010** 1.20±0.022 1.22±0.0053** 42.19±2.5

2.5 SGP对补体经典途径活性的影响

表5显示，SGP对人补体的经典途径活性具有显著的激活作用，呈现一定剂量-效应关系，当SGP质量浓度为5μg/mL 时，补体激活率达到42.19%。

3 结 论

扇贝性腺中蛋白质含量很高(占干质量的68.53%)，因此制备SGP的关键就是去除蛋白质。本实验采用多种蛋白酶联合酶解的方法制备得到SGP，其蛋白含量仅为14.43%，说明该酶解方案可有效去除蛋白质。由于多糖-蛋白质复合物中的蛋白质可能影响多糖复合物的生物活性，因此，本实验没有采取其他更为剧烈的方法进一步除去蛋白质[10]。具有一定的蛋白质，这也是动物多糖不同于植物多糖的重要特点之一。

自由基生成过多，严重危害人体健康，很多疾病过程都与自由基代谢相关[11]。因此，自由基的生成控制一直是研究的热点之一。研究发现，SGP能够清除DPPH自由基和羟自由基，且具有一定的还原能力。同时，SGP还能够降低tBOOH对RAW264.7细胞造成的氧化损伤，对氧化损伤具有一定的保护和防御作用。SGP的抗氧化能力与其具有多羟基结构和糖醛酸结构有关。

淋巴细胞是参与机体免疫应答的重要细胞，其增殖能力关系到应答水平及免疫能力的强弱。本实验结果表明，较低质量浓度的SGP(0.2μg/mL)可明显促进淋巴细胞的增殖活性，提示SGP对细胞免疫功能具有潜在的增强作用。补体是人体正常的免疫防御系统之一，主要包括经典途径、旁路途径和凝集素途径[12]。研究发现，SGP能够激活补体的经典途径，这种激活作用可能与其结构中的硫酸根、糖醛酸和少量氨基半乳糖有关[13]。SGP对旁路途径及凝集素途径的影响还有待进一步研究。

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Antioxidant and Immunomodulating Activities of Polysaccharide from Scallop Gonad

SONG Sun-yang1,2，SUN Li-ming1,2,*，ZHU Bei-wei1,2，NIU Hai-ling1,2，YANG Jing-feng1,2
(1. School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2. National R&D Branch Center for Shellfish Processing, Dalian 116034, China)

Scallop gonad polysaccharide extract (SGP) was obtained by hydrolysis with a series of commercial enzymes. Its antioxidant activity was evaluated by DPPH system, Fenton system and reduction reaction. MTT assay was used to evaluate its effect on tBOOH-induced oxidative damage and lymphocyte proliferation. The effect on complement activity was evaluated by spectrophotometry. The results indicated that SGP had reducing power and scavenging effect on DPPH and hydroxyl free radicals. SGP at the 0.2μg/mL could also protect RAW264.7 cells from oxidative damage induced by tBOOH. Moreover, SGP could also promote lymphocyte proliferation and activate complement activity.

scallop gonad；polysaccharide extracts；antioxidant；lymphocyte proliferation；complement

TS254.9

A

1002-6630(2012)05-0248-04

2011-03-10

“十一五” 国家科技支撑计划项目(2008BAD94B07)；辽宁省重点实验室建设项目(2008403003)；辽宁省教育厅创新团队计划项目(2009T033；2008T007)

宋荪阳(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为水产品深加工。E-mail：ssy80904@126.com

孙黎明(1974—)，女，副教授，博士，研究方向为海洋活性天然产物。E-mail：sunlm@dicp.ac.cn