丰年虫水溶性蛋白的分离纯化及体外抗氧化性研究

聂 路，张建新*，李文学，刘 胐

(西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100)

丰年虫水溶性蛋白的分离纯化及体外抗氧化性研究

聂 路，张建新*，李文学，刘 胐

(西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100)

目的：对丰年虫水溶性蛋白进行分离纯化，获得体外抗氧化活性最好的水溶性蛋白组分，并测定其分子质量。方法：丰年虫水溶性粗蛋白经硫酸铵沉淀、透析、DEAE-Sepharose FF离子交换层析和Sephadex G-100凝胶层析分离纯化，对纯化后的蛋白质进行体外抗氧化活性的研究，利用SDS-PAGE电泳测定蛋白质分子质量。结果：丰年虫水溶性蛋白经DEAE-Sepharose FF离子交换层析，梯度洗脱得到4个洗脱峰(峰1～4)，峰2的体外抗氧化活性最强。峰2经Sephadex G-100凝胶层析分离纯化得到3个洗脱峰(峰2-1～2-3)，峰2-1的体外抗氧化活性最强。利用SDS-PAGE对峰2-1进行鉴定，得到单一蛋白条带，纯度较高，蛋白分子质量为82.47kD。体外抗氧化活性比较，峰2-1远远强于水溶性粗蛋白。结论：蛋白组分峰2-1体外抗氧化活性最强，为单一蛋白组分，其分子质量为82.47kD。

丰年虫；水溶性蛋白；分离纯化；抗氧化活性

丰年虫(Eubranchipus vernalis)，又名丰年虾、咸水丰年虾，是无甲目(Anostraca)甲壳动物。研究表明，丰年虫富含蛋白质等营养物质，根据Saito法，对其蛋白质进行分类提取，发现水溶性蛋白的体外抗氧化活性最强[1]。本研究通过硫酸铵沉淀、透析、D E A ESepharose FF离子交换层析和Sephadex G-100凝胶层析分离纯化丰年虫水溶性蛋白，测定其羟自由基(·OH)，超氧阴离子自由基(O2－·)和DPPH自由基清除率，研究丰年虫水溶性蛋白的体外抗氧化活性，利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对所纯化的蛋白进行鉴定，为对丰年虫蛋白质全方位多用途开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

丰年虫，由陕西丰源生物科技有限公司提供。

DEAE-Sepharose FF纤维素、Sephadex G-100 西安沃尔森有限责任公司；石油醚、三羟甲基氨基甲烷(tris)、浓盐酸、硫酸亚铁、双氧水、水杨酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、邻苯三酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、硫酸铵、聚乙二醇6000、考马斯亮蓝R250等均为分析纯；SDS、丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺、四甲基乙二胺均为电泳级。

1.2 仪器与设备

FA2004分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；DF-101S恒温磁力搅拌器 郑州长城科工贸有限公司；KDC-40低速离心机 科大创新股份有限公司中佳分公司；ZDJ-4A型自动电位滴定仪 上海精密科学仪器有限公司；UV-2550紫外分光光度计 日本岛津公司；PM180R高速冷冻离心机、SIM-FD5505P真空冷冻干燥机 德国西门子公司；自KDY-9830动凯氏定氮仪Ketuo公司；层析柱(玻璃柱1.60cm×100cm、1.60cm×50cm) 自制；SBS-100数控记滴自动部份收集器、HL-2B数显恒流泵 上海沪西分析仪器厂有限公司；电泳槽(8.2cm×8.5cm) 北京市六一仪器厂；EPS-300型电泳仪上海民仪电子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 丰年虫脱脂粉的制备

丰年虫经60℃烘干至恒质量，研钵冰浴2h，研磨过80目筛，用石油醚对丰年虫进行索氏提取脱脂，脱脂粉在室温下风干12h，置于4℃冰箱保存备用。

1.3.2 丰年虫水溶性蛋白质的提取

根据Saito法[2]，提取丰年虫水溶性蛋白，取5g丰年虫脱脂粉，加入10倍体积的0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，40℃搅拌提取120min，3500r/min离心20min，收集上清液。测定上清液中水溶性蛋白含量。蛋白质含量测定采用凯氏定氮法，参照GB 5009.5－2010《食品中蛋白质的测定》[3]。

在上清液中加入硫酸铵固体至饱和度为70%(0℃硫酸铵70%饱和度质量浓度为472g/L)，0℃放置30min，10000r/min离心10min，沉淀溶于0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，在4℃条件下透析48h，冷冻干燥，所得即为水溶性蛋白[4]。

1.3.3 丰年虫水溶性蛋白的分离与纯化过程

丰年虫水溶性蛋白提取液→硫酸铵分级沉淀(70%饱和度)→透析→DEAE-Sepharose FF离子交换层析→体外抗氧化活性测定→Sephadex G-100凝胶层析→体外抗氧化活性测定→SDS-PAGE电泳

1.3.4 DEAE-Sepharose FF离子交换层析

取20mg丰年虫水溶性蛋白粗品，溶于2mL 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，3000r/min离心10min，取上清液加入DEAE-Sepharose FF离子交换柱(1.6cm×50cm)，先用0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)洗脱未被吸附的蛋白质，再用含0.1～0.5mol/L NaCl的0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)连续洗脱被吸附的蛋白质，洗脱速率1mL/min，每5mL收集一管，每种浓度洗脱100mL，280nm波长处逐管检测，收集洗脱峰，用聚乙二醇6000反透浓缩洗脱峰，冷冻干燥[5]。

1.3.5 Sephadex G-100凝胶层析

取20mg经DEAE-Sepharose FF离子交换层析后冷冻干燥样品，溶于2mL 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，3000r/min离心10min，取上清液加入Sephadex G-100凝胶柱(1.6cm×100cm)，用0.02mol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，洗脱速率0.4mL/min，每4mL收集一管，洗脱液体积为柱体积3倍。280nm波长处逐管检测，收集洗脱峰，用聚乙二醇6000反透浓缩洗脱峰，冷冻干燥[6]。

1.3.6 SDS-PAGE电泳分析

SDS-PAGE电泳采用不连续体系进行。在蛋白质样品中加入质量分数为2%的SDS和β-巯基乙醇后，100℃水浴3min。分离胶12%，浓缩胶4%[7]，电极缓冲液用Tris-甘氨酸电极缓冲液。用水-异丙酮-冰醋酸(体积比13:5:2)的0.1%考马斯亮蓝R250染色，水-乙醇-冰醋酸(体积比1 7:1:2)脱色。恒流电泳，浓缩胶电泳电流10mA，分离胶电泳电流20mA。浓缩胶电泳时间1h，分离胶电泳时间3h。采用低分子质量标准蛋白质作为对照[8]，计算纯化后蛋白质分子质量，溴酚蓝为指示剂[9]。1.3.7 体外抗氧化活性测定

体外抗氧化研究主要选定·OH、O2－·和DPPH自由基。·OH清除率：参照水杨酸法[10]；O2－·清除率：参照邻苯三酚自氧化法[11]；DPPH自由基清除率：参照Boonmee[12]、Brand-Williams[13]等的方法。

2 结果与分析

2.1 丰年虫水溶性蛋白质提取率

由表1可知，丰年虫脱脂粉中总蛋白和水溶性蛋白含量分别占脱脂粉的60.18%和33.64%，水溶性蛋白占总蛋白的55.90%。

表1 丰年虫脱脂粉中水溶性蛋白质相对百分含量Table 1 Relative content of water-soluble protein in Eubranchipus vernalis

2.2 DEAE-Sepharose FF离子交换层析

图1 丰年虫水溶性蛋白DEAE-Sepharose FF柱洗脱图谱Fig.1 Purification profile of water-soluble protein from Eubranchipus vernalis on DEAE-sepharose fast flow anion-exchange column

由图1可知，丰年虫水溶性粗蛋白经D E A ESepharose FF离子交换层析，用0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)和0.1～0.3mol/L NaCl的0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)洗脱，分别得到一个洗脱峰(峰1～4)，0.4mol/L NaCl-0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)和0.5mol/L NaCl-0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)没有得到洗脱峰[14]。峰1直接被0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)洗脱下来，说明该部分蛋白质不能为离子交换剂所吸附。随着洗脱液离子强度的增大，与离子交换柱结合紧密的蛋白质也被洗脱下来，分别为峰2、峰3、峰4。分别收集这4个洗脱峰，用聚乙二醇6000浓缩，冷冻干燥备用。

2.3 DEAE-Sepharose FF离子交换层析的洗脱峰体外抗氧化活性测定

表2 DEAE-Sepharose FF离子交换层析各峰组分体外抗氧化活性结果(±s, n=3)Table 2 Antioxidant activity of each fraction obtained by DEAE-sepharose fast flow anion-exchange chromatography(± s, n=3)

表2 DEAE-Sepharose FF离子交换层析各峰组分体外抗氧化活性结果(±s, n=3)Table 2 Antioxidant activity of each fraction obtained by DEAE-sepharose fast flow anion-exchange chromatography(± s, n=3)

注：同列小写字母不同，表示差异显著(P＜0.05)；同列大写字母不同，表示差异极显著(P＜0.01)。下同。

蛋白组分 ·OH清除率/%O2－·清除率/%DPPH自由基清除率/%峰1 11.15±0.35aA 40.48±0.68aA 40.93±0.74aA峰2 14.56±0.47bA 55.57±0.38bB 65.63±0.90bB峰3 7.63±0.33cB 38.39±0.33bB 29.49±0.35cC峰4 4.89±0.88dB 31.31±1.56cC 28.80±0.65cC

DEAE-Sepharose FF离子交换层析获得的4个洗脱峰的冻干品，配制成0.05mg/mL蛋白质溶液，测定其体外抗氧化活性。由表2可知，·OH、O2－·和DPPH自由基清除率的测定结果大小排序均为：峰2＞峰1＞峰3＞峰4，峰2对·OH、O2－·和DPPH自由基的清除率分别为14.56%、55.57%和65.53%。因此实验将大量收集峰2进行下一步纯化。

2.4 Sephadex G-100凝胶层析

葡聚糖凝胶分离蛋白质根据分子筛原理，蛋白质按分子质量大小从大到小洗脱下来。Sephadex G-100凝胶层析见图2。

图2 Sephadex G-100分离纯化峰2的洗脱图谱Fig.2 Purification profile of Peak-2 on Sephadex G-100 gel permeation column

由图2可知，Sephadex G-100凝胶层析分离纯化峰2，出现3个蛋白峰(峰2-1、峰2-2和峰2-3)，分别收集这3个洗脱峰，用聚乙二醇6000浓缩，冷冻干燥备用。2.5 Sephadex G-100凝胶层析洗脱峰体外抗氧化活性测定

Sephadex G-100凝胶层析获得的3个洗脱峰冻干品，配制成0.05mg/mL蛋白质溶液，测定其体外抗氧化活性。由表3可知，·OH清除率大小排序为：峰2-1＞峰2-3＞峰2-2，而O2－·和DPPH自由基清除率的结果大小排序大致为：峰2-1＞峰2-2＞峰2-3，峰2-1对·OH、O2－·和DPPH自由基的清除率分别为23.22%、58.35%和71.37%。因此对峰2-1采用SDS-PAGE电泳鉴定其分子质量。

表3 Sephadex G-100凝胶层析各峰组分体外抗氧化活性测定Table 3 Antioxidant activity of each sub-fraction obtained by Sephadex G-100 gel permeation chromatography

2.6 SDS-PAGE电泳结果

图3 峰2-1组分SDS-PAGE电泳图谱Fig.3 SDS-PAGE of Peak 2-1

由图3可知，经DEAE-Sepharose FF离子交换层析和Sephadex G-100凝胶层析后的蛋白质样品纯度较高，是单一条带。通过标准蛋白对照，可以得到该蛋白条带的分子质量为82.47kD。

2.7 丰年虫水溶性粗蛋白与峰2-1体外抗氧化活性比较

2.7.1 ·OH清除率比较

图4 ·OH清除率测定结果Fig.4 Scavenging activity of Peak 2-1 and crude protein against hydroxyl free radicals

由图4可知，丰年虫水溶性粗蛋白和峰2-1对·OH都有抑制作用，且随着蛋白质质量浓度的增加而增强。比较水溶性粗蛋白和峰2-1，发现在不同蛋白质质量浓度下，峰2-1的·OH清除率都要高于水溶性粗蛋白。抗氧化机理可能是蛋白质提供的氢和·OH结合，形成稳定的自由基并阻止了自由基链式反应。另外一种可能就是蛋白质能够和自由基链式反应中必需的离子结合，从而阻止反应进行[15]。

图5 ·清除率测定结果Fig. 5 Scavenging activity of Peak 2-1 and crude protein against superoxide anion free radicals

2.7.3 DPPH自由基清除率比较

图6 DPPH自由基清除率测定结果Fig.6 Scavenging activity of Peak 2-1 and crude protein against DPPH free radicals

由图6可知，丰年虫水溶性粗蛋白和峰2-1对DPPH自由基清除率随蛋白质质量浓度的增大而增强。比较它们的DPPH自由基清除率，发现峰2-1要远远大于水溶性粗蛋白。

3 结 论

研究结果表明，丰年虫水溶性粗蛋白经DEAESepharose FF离子交换层析分离纯化得到4个洗脱峰(峰1～4)，体外抗氧化实验表明，峰2的体外抗氧化活性最好。峰2经Sephadex G-100凝胶层析分离纯化得到3个洗脱峰(峰2-1、峰2-2、峰2-3)，体外抗氧化实验表明，峰2-1的体外抗氧化活性最好。用SDS-PAGE电泳鉴定峰2-1，发现是单一蛋白组分，分子质量为82.47kD。对丰年虫水溶性粗蛋白和峰2-1进行体外抗氧化实验，比较它们的抗氧化活性，发现·OH、O2－·和DPPH自由基清除率，峰2-1都远远强于水溶性粗蛋白。

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Antioxidant Activity of Water-Soluble Protein Purified fromEubranchipus vernalis

NIE Lu，ZHANG Jian-xin*，LI Wen-xue，LIU Fei
(College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Objective: To isolate and purify water-soluble protein with the highest antioxidant activity fromEubranchipus vernalisand determine its molecular weight. Methods: Crude water-soluble protein fromEubranchipus vernaliswas extracted and purified by ammonium sulfate precipitation, salting out, ion-exchange column chromatography, DEAE-fast-flow Sepharose anion-exchange chromatography and Sephadex G-100 column chromatography. The antioxidant activities of different protein fractions were compared and their molecular weights were determined by SDS-PAGE. Results: The prepared crude watersoluble protein was mainly composed of 4 fractions named as Peak-1, Peak-2, Peak-3 and Peak-4 in DEAE-Sepharose fast-flow column chromatography and Peak-2 revealed higher antioxidant activity than other 3 fractions. In addition, Peak-2 was mainly composed of 3 sub-fractions including Peak 2-1, Peak 2-2 and Peak 2-3 in Sephadex G-100 gel-permeation column chromatography.Peak 2-1 exhibited higher antioxidant activity than other 2 sub-fractions. Peak 2-1 was identified by SDS-PAGE to reveal a molecular weight of 82.47 kD. The antioxidant activity of Peak 2-1 was much higher than that of the crude protein extract.Conclusion: Peak 2-1 has obtained fromEubranchipus vernalisas the most antioxidant protein with a molecular weight of 82.47 kD.

Eubranchipus vernalis；water-soluble protein；purification；antioxidant activity

TS254.4

A

1002-6630(2012)15-0122-05

2011-07-08

国家大学生创新性实验计划项目(2009A18)

聂路(1986—)，男，硕士研究生，主要从事食品营养与安全研究。E-mail：liuxingynly@163.com

*通信作者：张建新(1959—)，男，教授，硕士，主要从事食品营养与安全研究。E-mail：zhangjx59@foxmail.com