温州蜜柑、椪柑采后酚类物质及抗氧化活性比较研究

沈 妍，叶兴乾*

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058)

温州蜜柑、椪柑采后酚类物质及抗氧化活性比较研究

沈 妍，叶兴乾*

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058)

通过研究温州蜜蜂柑、椪柑两个常见柑橘品种贮藏期间类黄酮、酚酸类物质及抗氧化活性的变化规律，评价其采后的营养品质。结果表明：贮藏60d后温州蜜柑较好地保持了抗坏血酸含量，而椪柑损失较大。类黄酮类物质较稳定，温州蜜柑中黄烷酮含量贮藏后有所增加，椪柑中则呈缓慢下降趋势，2种柑橘中酚酸类物质贮藏后都有所增加。总酚含量在贮藏前期呈下降趋势，贮藏后期温州蜜柑中总酚含量增加而在椪柑中进一步下降。抗氧化能力与抗坏血酸的变化趋势类似。与椪柑相比，贮藏期间温州蜜柑能更好地保持果实的营养品质及酚类物质，从而保持较高的抗氧化活性。

柑橘；贮藏；类黄酮；酚酸；抗氧化能力

柑橘是世界上最重要的农产品之一，品种丰富且产量高，是人们膳食的重要组成部分。柑橘果实富含VC、各种氨基酸、有机酸等营养成分，同时也是一些生理活性成分的重要来源，如类黄酮、酚酸等酚类物质、柠檬苦素、类胡萝卜素等。近年来的众多研究[1-2]表明柑橘中的酚类物质具有预防慢性疾病、抗癌、抗炎、抗氧化等多种生理功能，因此也越来越受人们关注。但国内外在柑橘果实采后酚类物质和抗氧化活性变化方面的研究很少[3-4]，特别是对具体的酚类物质的研究。本实验以2种常见宽皮柑橘为材料，研究其采后酚类物质及抗氧化活性的变化，以探索柑橘采后贮藏过程中功能成分的变化规律，旨在为柑橘果实品质及其贮藏加工研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

温州蜜柑、椪柑，由浙江黄岩柑橘研究所提供，正常成熟度采收。

柚皮芸香苷、橙皮苷、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、芥子酸、福林酚试剂、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、三吡啶三吖嗪(TPTZ) 美国Sigma公司；液相色谱用甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

KA-1000型离心机 上海安亭科学仪器厂；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；Waters 2695高效液相色谱(配有Waters 2998二极管陈列检测器) 美国Waters公司；UV-2550紫外-可见光分光光度计 日本岛津公司；Agilent SB-C18反相色谱柱(250nm×4.6mm，5μm) 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

柑橘采收后不经处理，选取大小均匀、无病害损伤的果实，经自来水清洗晾干后，装入纸箱于10℃库房贮藏2个月。每15d测定一次指标，每次随机取15个果实，做3个重复，果实去皮榨汁后用4层纱布过滤用于测定。

1.3.2 果实品质指标的测定

可溶性固形物含量(SSC)：采用阿贝折光仪测定；可滴定酸(TA)：采用NaOH滴定法测定。

1.3.3 抗坏血酸含量的测定

参照文献Xu Guihua等[5]的方法，1.000g果汁加入6mL 0.1g/100mL的草酸混合提取3min，于4000r/min离心10min，残渣再提取，上清液混合定容于10mL容量瓶，立即通过0.45μm的水膜后注入液相色谱。使用C18反相色谱柱(250mm×6mm，5μm)，以0.1g/100mL草酸为流动相，流速为1.0mL/min，柱温为25℃，作抗坏血酸标准曲线，在243nm波长处进行外标法定量。

1.3.4 烷酮糖苷含量的测定

参照文献Xu Guihua等[5]的方法，1.000g果汁加入6mL 80%甲醇-甲基亚砜(1:1，V/V)混合液混合均匀，提取10min，4000r/min离心20min，残渣再提取，上清液混合定容于10mL容量瓶。取10μL经0.22μm滤膜过滤的提取液注入高效液相色谱系统，使用C18反相色谱柱，以4%乙酸-甲醇(37:63，V/V)作为动相，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，样品洗脱时间为15min，检测波长为283nm，配制柚皮芸香苷、橙皮苷混合标准溶液，制得标准曲线，外标法定量。实验结果表明，柚皮芸香苷和橙皮苷标样质量浓度分别在25～130μ g/mL和200～1000μg/mL范围内与峰面积线性关系良好(R2＞0.999)，测定可重复性、回收率、标准偏差结果良好。

1.3.5 酸含量的测定

酚酸的提取参照Nardini等[6]的方法，取2.000g果汁加3mL蒸馏水，加入5mL 4mol/L的NaOH溶液(含1g/100mL抗坏血酸和10mmol/L EDTA)氮气保护下碱水解4h。用6mol/L盐酸调pH值至1～2，4000r/min离心10min，上清液用乙酸乙酯-乙醚(1:1，V/V)萃取3次(与上清液体积比1:1)，合并萃取液，用无水硫酸钠干燥后滤纸过滤，于30℃旋转蒸发浓缩至干，用甲醇定容至10mL。过0.22μm有机滤膜后进样，色谱柱为C18反相色谱柱，以4%乙酸-甲醇(80:20，V/V)作为流动相，流速为1mL/min，柱温为3 0℃，检测波长为320nm，样品洗脱35min[7]。配制咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、芥子酸混合标准溶液，作标准曲线，外标法定量。结果表明，4种酚酸分别在0.2～1.0、2～10、5～25、0.2～1.0μg/mL范围内标样质量浓度与峰面积线性关系良好(R2＞0.999)，测定可重复性、回收率、标准偏差结果良好。

1.3.6 总酚含量测定

参照Singleton等[8]的方法(Folin-酚法)，1.000g果汁加入6mL 80%的甲醇，4000r/min离心20min，残渣再提取，上清液混合定容于10mL容量瓶。25mL容量瓶中加入9mL蒸馏水，加入1mL样品提取液，混匀后加0.5mL Folin-酚试剂，并不断振摇使之迅速反应。放置5min后加入5mL 5g/100mL的Na2CO3溶液，边加边用蒸馏水振摇并定容至25mL。60min后于750nm波长处测定吸光度，以二次蒸馏水为空白。以没食子酸作标准曲线，计算没食子酸当量总酚含量 (gallic acid equivalent content，GAE)。

1.3.7 DPPH自由基清除率的测定[9]

样品提取同1.3.5节，0.2mL提取液加入到2.8mL 0.1mmol/L DPPH试剂中，避光反应30min，于517nm波长处测吸光度，空白为0.2mL 80%甲醇溶液加入到2.8mL DPPH试剂中的吸光度。

式中：A1为空白吸光度；A2为样品吸光度。

1.3.8 FRAP铁离子还原能力的测度

参照Benzie等[10]的方法，样品提取同总酚，4.9mL FRAP试剂(由pH3.6的0.1mol/L醋酸缓冲液、10mmol/L TPTZ、20mmol/L三氯化铁溶液以体积比10:1:1混合配制)与0.1mL提取液混匀后于37℃反应10min后在593nm波长处测吸光度，空白为0.1mL 80%甲醇溶液。以抗坏血酸作标准曲线，计算抗坏血酸当量抗氧化能力(AEAC)。

1.4 数据处理

使用Origin 8.0对数据进行图表制作，SPSS软件对数据显著性进行分析(α＝0.05)。

2 结果与分析

2.1 温州蜜柑和椪柑采后基本品质指标变化

柑橘属于非跃变型果实，采后营养成分不会发生显著的变化，果实的糖酸含量是影响果实风味的主要因素。如表1所示，温州蜜柑和椪柑贮藏期间TSS都呈略微上升趋势，而TA贮藏后含量下降，其中椪柑TA下降较显著，pH值则反映了TA的变化趋势。果实采后有机酸会作为呼吸作用底物被消耗，而淀粉等多糖转化为可溶性碳水化合物，不溶性原果胶转化为可溶性果胶等溶于果汁，使SSC上升[11]。随着贮藏期的延长，SSC含量的增加及TA的下降会提高果实糖酸比，改善果实风味，但下降过快则会使果实风味不足。可见，经贮藏椪柑果实的可滴定酸下降过快，其风味损失较快，而温州蜜柑变化较小。

表1 温州蜜柑和椪柑贮藏期品质指标变化Table 1 Change in quality parameters of satsuma mandarin and ponkan fruits during storage

2.2 温州蜜柑和椪柑采后抗坏血酸含量变化

图1 温州蜜柑和椪柑贮藏期间抗坏血酸含量变化Fig.1 Change in ascorbic acid content of satsuma mandarin and ponkan fruits during storage

抗坏血酸是柑橘果实的主要营养成分，具有良好的抗氧化作用，因此也是评价果实营养品质的重要指标。众多研究表明随着果实的衰老，抗坏血酸也会逐渐损失。由图1可知，选取的2个品种中温州蜜柑的抗坏血酸含量更高，贮藏前2个品种中含量分别为(346.36±3.45)mg/kg和(289.20±7.45)mg/kg。在贮藏过程中两个品种抗坏血酸含量变化差异较大。温州蜜柑在贮藏过程中抗坏血酸变化较平缓，贮藏60d后有略微地下降。而椪柑在贮藏15d后抗坏血酸含量显著下降，贮藏时间越长损失越大。可见椪柑果实贮藏后营养成分损失较显著，而温州蜜柑变化不大，这与果实的耐贮性和果皮组织等有关。

2.3 温州蜜柑和椪柑采后黄烷酮糖苷含量变化

柑橘中的类黄酮主要以黄烷酮糖苷形式存在，主要包括柚皮芸香苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷等，另外还有川橙皮素、橘皮素等多甲氧基黄酮。黄酮类物质在人和动物体具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、降低毛细血管脆性、抗过敏、抑制血小板凝集等多方面的药理作用。柑橘中黄烷酮糖苷含量丰富，以橙皮苷为主，果汁中橙皮苷含量高达200～500mg/L，但品种间差异较大[5]。表2所示为温州蜜柑和椪柑在贮藏过程中两种黄烷酮糖苷含量的变化。可见橙皮苷是2种柑橘的主要黄酮类物质，其含量显著高于柚皮芸香苷。椪柑中的橙皮苷含量远高于温州蜜柑，但其柚皮芸香苷含量仅为温州蜜柑的一半左右。经贮藏，椪柑中的橙皮苷和柚皮芸香苷含量都呈逐渐下降趋势，但变化较平缓。温州蜜柑中的黄烷酮糖苷则在贮藏过程中有上升过程，在30d时两种物质含量都显著增加，之后显著下降，贮藏60d后又呈上升趋势。研究表明类黄酮物质在果蔬采后可能会继续合成，贮藏后含量增加，其含量的下降则可能由果实衰老造成，同时果实贮藏后期失水也会对其含量产生影响[12-13]。

表2 温州蜜柑和椪柑贮藏期间黄烷酮糖苷含量变化Table 2 Change in flavanone content of satsuma mandarin and ponkan fruits during storage

2.4 温州蜜柑和椪柑采后酚酸含量变化

柑橘众多品种中酚酸类物质主要为肉桂酸型酚酸，包括香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸。近年来发现酚酸具有抗氧化、抗炎症、抗突变、抗心血管疾病等多种生理功能[14-15]。表3所示为温州蜜柑和椪柑贮藏期间酚酸含量的变化。可见阿魏酸是2种柑橘中含量最丰富的酚酸类物质，2个品种阿魏酸含量相当，而咖啡酸、对香豆酸、芥子酸的含量不同，温州蜜柑中的对香豆酸＞咖啡酸＞芥子酸，而椪柑中咖啡酸＞芥子酸＞对香豆酸。贮藏后2个品种中4种酚酸含量都有所增加，除了芥子酸外都有显著变化。温州蜜柑中阿魏酸在贮藏30d前含量显著增加之后略有下降，椪柑中的阿魏酸则是在贮藏45d显著增加。温州蜜柑中的咖啡酸含量贮藏15d前显著增加，之后变化较平缓，而椪柑中的咖啡酸含量在贮藏前期显著下降，贮藏后期显著增加。温州蜜柑中对香豆酸含量在贮藏30d前显著降低，之后其含量显著增加，椪柑则是前期变化不显著，贮藏60d后含量显著增加。贮藏过程中2种柑橘中芥子酸的变化都不显著，贮藏后略有增加，其中椪柑上升幅度更大。可见，贮藏后2个品种柑橘的酚酸含量都有所增加，其中椪柑的增加幅度更大。果蔬中的酚酸类物质较稳定，在贮藏期间仍能保持其含量并有所增加，但其机理还有待研究。

表3 温州蜜柑和椪柑贮藏期酚酸含量的变化Table 3 Change of phenolic acids in satsuma mandarin and ponkan fruits during storage

2.5 温州蜜柑和椪柑采后总酚含量变化

图2 温州蜜柑和椪柑贮藏期间总酚含量变化Fig.2 Change in total content of phenolic compounds in satsuma mandarin and ponkan fruits during storage

柑橘的总酚含量和抗坏血酸、花色素、类黄酮、酚酸等物质有关。图2为温州蜜柑和椪柑采后总酚含量的变化。可见2种柑橘在贮藏前45d，总酚含量都呈略微下降趋势，且含量相当，但在贮藏60d后，温州蜜柑的总酚含量显著增加，椪柑则进一步下降。这可能是抗坏血酸、类黄酮、酚酸类物质变化的综合结果，黄酮类物质和酚酸类物质贮藏后含量的增加导致了温州蜜柑总酚含量的增加，而由于椪柑贮藏后期抗坏血酸含量的大幅下降其总酚含量继续下降。

2.6 温州蜜柑和椪柑采后抗氧化能力变化

图3 温州蜜柑和椪柑贮藏期间DPPH自由基清除率(A)和FRAP值(B)的变化Fig.3 Change in DPPH radical scavenging capacity and FRAP value of satsuma mandarin and ponkan fruits during storage

由图3可知，2种方法(FRAP法和DPPH法)测得的抗氧化能力变化趋势类似。贮藏期间温州蜜柑的抗氧化能力变化较平缓，贮藏前期略微上升，后期下降。而椪柑经贮藏后，抗氧化能力显著下降，这与抗坏血酸含量的变化趋势较类似。柑橘中VC、花色素、类黄酮、酚酸等物质的含量都会影响其抗氧化能力，柑橘含有丰富的抗坏血酸，因此抗坏血酸可能是影响其抗氧化能力的主要因素。

3 结 论

柑橘贮藏期间营养成分损失较缓慢，但不同品种差异较显著。经过长期的贮藏，温州蜜柑能较好地保持果实的营养品质及酚类物质，从而保持其较高的抗氧化活性。椪柑贮藏后营养品质损失较大，如可滴定酸与抗坏血酸，从而显著降低了其抗氧化活性。酚类物质在贮藏过程中较稳定，贮藏后温州蜜柑中的黄酮类物质有所增加，椪柑中则缓慢下降，酚酸类物质在2种柑橘采后贮藏过程中都有所增加，这可能与酚类物质合成的一些酶活性有关。抗氧化能力与抗坏血酸变化趋势类似，同时又与酚类物质的变化相关。总的来说，温州蜜柑经长期贮藏后不会影响其酚类物质和抗氧化活性，具有较好的功能营养品质及贮藏加工特性。但目前柑橘采后酚类物质及抗氧化活性变化还缺乏系统的研究，其变化机理也有待进一步明确。

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Comparison of Phenolic Compounds and Antioxidant Activity in Satsuma Mandarin and Ponkan during Storage

SHEN Yan，YE Xing-qian*
(School of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

The regularity of changes in phenolic compounds (flavonoids and phenolic acids) and antioxidant activity of citrus fruits from two common varieties, satsuma mandarin and ponkan during storage were determined for the evaluation of postharvest functional quality. The results indicated that ascorbic acid content revealed a drastic decrease in ponkan fruits during storage for 60 days while satsuma mandarin maintained a high level. Phenolic compounds in both varieties were stable. Flavanone content increased after storage in satsuma mandarin but decreased in ponkan. Phenolic acids increased in both varieties. The content of total phenolic compounds gradually decreased during the early storage period, and increased in satsuma mandarin in the end of storage. Antioxidant activity and ascorbic acid content showed similar change trends. Satsuma mandarin maintained better fruit quality and higher content of phenolic compounds as well as antioxidant activity when compared with ponkan.

citrus；storage；flavonoids；phenolic acids；antioxidant activity

TS205

A

1002-6630(2012)15-0038-05

2011-07-06

“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAD27B06)

沈妍(1986—)，女，博士研究生，研究方向为柑橘功能性成分研究。E-mail：04spkxsy@zju.edu.cn

*通信作者：叶兴乾(1962—)，男，教授，博士，研究方向为果蔬加工和食品工艺。E-mail：psu@zju.edu.cn