固相萃取-流动注射化学发光法测定动物肝脏中的盐酸二氟沙星

朱盈蕊，高向阳*，赵 琛

(河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州 450002)

固相萃取-流动注射化学发光法测定动物肝脏中的盐酸二氟沙星

朱盈蕊，高向阳*，赵 琛

(河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州 450002)

碱性条件下，基于盐酸二氟沙星对鲁米诺-过氧化氢化学发光反应体系的抑制作用，样品经固相萃取柱处理后用该体系测定，建立快速分析猪肝、鸡肝中盐酸二氟沙星的流动注射化学发光新方法。结果表明：盐酸二氟沙星质量浓度在1.00×10-5～1.00×10-9mg/mL范围内，质量浓度的负对数与体系的相对化学发光强度呈良好线性关系，方法检出限为4.07×10-9mg/mL，相对标准偏差(RSD)为0.93%(n=11)。该方法用于动物肝脏中盐酸二氟沙星残留的检测，结果令人满意。

盐酸二氟沙星；流动注射化学发光法；动物肝脏；固相萃取

盐酸二氟沙星(difloxacin hydrochloride，DIF)是一类动物专用氟喹诺酮类药物，具有抗菌谱广、杀菌效强、口服吸收迅速、半衰期长、与其他抗菌药物无交叉耐药性、低毒、高效等特点，对畜禽呼吸道致病菌有良好的抗菌活性，主要用于治疗猪和禽类的敏感细菌及支原体所致的各种感染性疾病[1-2]，该类药物的研究已有文献报道[3-5]。抗菌药因其治疗效果优异，广泛应用于疾病的预防和控制，其中包括氟喹诺酮类药物。随着该类药物使用量的增大，各种毒副作用逐渐显现，会引起恶心、呕吐、头痛、心悸等直接毒性反应，还可引起光毒性皮炎，而逐渐受到人们的高度关注，国家农业部对动物性食品中兽药最高残留限量做了规定[6]。因此，研究盐酸二氟沙星在动物性食品中的残留，对保障食品安全和维护人体健康有一定的现实意义。

目前，二氟沙星残留的主要分析方法有高效液相色色谱-质谱联用法[7-9]、超高液相色谱-质谱联用法[10-13]、高效液相色谱法[14]、酶联免疫法[15-16]等。前两种方法设备昂贵，酶联免疫法操作复杂，有时无法满足工作需要。流动注射化学发光法具有快速简便、设备简单、灵敏度高、重复性好、线性范围宽、自动化程度高的显著特点，已广泛应用于药物分析、环境监测等领域[17-20]，但未见有流动注射化学发光法分析食品中盐酸二氟沙星的报道。本实验拟建立一种快速测定盐酸二氟沙星的新方法，可用于动物肝脏中微量盐酸二氟沙星的测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡肝、猪肝 市售。

盐酸二氟沙星标准品(质量分数99.8%) 中国兽医药品监察所；的鲁米诺(质量分数＞99%) 苏州工业园区亚科化学试剂有限公司；过氧化氢(质量分数30%) 烟台市双双化工有限公司；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，实验用水为石英亚沸二次重蒸水。

0.20mg/mL盐酸二氟沙星储备液：准确称取0.0050g盐酸二氟沙星标准品，用重蒸水溶解后定容于25mL棕色容量瓶，4℃冰箱中保存，使用时用重蒸水逐级稀释至所需浓度；1.0×10-2mol/L鲁米诺贮备液：准确称取鲁米诺0.4425g用0.10mol/L氢氧化钠溶液溶解并定容于250mL棕色容量瓶中，混匀避光保存两周后使用，并逐级稀释到所需浓度；0.20mol/L过氧化氢溶液：准确吸取30%过氧化氢溶液5.10mL，用重蒸水定容于250mL棕色容量瓶中，混匀、备用，过氧化氢溶液需现配现用；0.10mol/L磷酸盐缓冲溶液：取磷酸二氢钾6.8g，加水溶解并定容于500mL。

1.2 仪器与设备

IFFM-D型流动注射生物发光分析仪 西安瑞迈电子科技有限公司；固相萃取装置(配C8柱) 美国Agilent公司；SKF-12超声波清洗器(额定功率500W) 上海科导超声仪器有限公司；FA2004A电子天平 上海精天电子仪器有限公司；台式高速冷冻离心机 力康发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的绘制

图1 流动注射化学发光流程示意图Fig.1 Schematic diagram of flow injection chemiluminescence analysis

用0.20mg/mL盐酸二氟沙星储备液配制成1.00×10-4mg/mL标准溶液，依次配制1.00×10-5、1.00×10-6、1.00×10-7、1.00×10-8、1.00×10-9mg/mL标准系列溶液，备用。同时配制空白溶液，按仪器工作参数测定，待仪器基线稳定后，注入标准溶液，记录其发光强度(I标)，设空白的化学发光强度为(I0)，以盐酸二氟沙星质量浓度的负对数为横坐标，以ΔI＝I0－I标为纵坐标绘制标准曲线。流动注射化学发光反应装置见图1。

1.3.2 样品的测定

样品用医用剪刀剪成块，匀浆，准确称取2.0000g于离心管中，准确加磷酸盐缓冲液10.00mL，在额定功率为500W超声波清洗器中超声5min后，12000r/min离心10min，取样品上清液过固相萃取柱。

固相萃取柱先用甲醇、磷酸盐缓冲液各2.00mL依次预洗。准确取样品上清液2.00mL注入，用体积比1:19的甲醇-磷酸盐混合液4.00mL，以10～15滴/min流速淋洗。弃去淋洗液后，用体积比1:19的氨水-甲醇混合溶液4.00mL，以10～15滴/min流速洗脱，定量收集洗脱液，于60～70℃氮气下吹干，加少量重蒸水溶解并定容于50mL棕色容量瓶中，同时处理和配制样品空白溶液，待测定。

在与标准曲线完全相同的条件下测定空白溶液和样品定容液的发光强度之差ΔIx＝I0－I样，代入标准曲线回归方程，求出样品定容液中盐酸二氟沙星的质量浓度(ρ)，按下式计算样品中盐酸二氟沙星的质量分数(ω)。

式中：m为称取样品的质量/g；ρ为盐酸二氟沙星的质量浓度/(mg/mL)。

2 结果与分析

2.1 测定条件的选择

2.1.1 化学发光仪工作参数的设定

光电倍增管负高压为450V、仪器增益为1时，对化学发光仪工作参数进行优化，结果表明仪器在表1参数下运行，发光信号稳定，且具有较大的信噪比。

表1 化学发光仪工作参数的设定Table 1 Working parameters of chemiluminescence instrument

2.1.2 反应介质及其浓度的选择

当鲁米诺浓度6.0×10-4mol/L，过氧化氢浓度0.050mol/L时，分别以0.10mol/L NaOH、Na2CO3、NaHCO3溶液为反应介质，按2.1.1节仪器工作参数，测定不同碱性介质对鲁米诺-过氧化氢化学发光体系的影响。实验表明：反应介质为氢氧化钠时，体系产生的化学发光强度较为理想。相同条件下，考察0.050～0.35mol/L氢氧化钠溶液对化学发光体系的影响，结果如图2所示。

图2 氢氧化钠浓度对相对化学发光强度的影响Fig.2 Effect of sodium hydroxide concentration on relative luminescence intensity

由图2可知，氢氧化钠浓度为0.10mol/L时，化学发光强度最大，选择0.10mol/L氢氧化钠为反应介质。

2.1.3 鲁米诺浓度的选择

氢氧化钠浓度为0.10mol/L、过氧化氢浓度为0.050mol/L，按2.1.1节仪器工作参数运行，考察鲁米诺在1.0×10-4～1.0×10-3mol/L范围内对化学发光强度的影响，见图3。

图3 鲁米诺浓度对相对化学发光强度的影响Fig.3 Effect of luminol concentration on relative luminescence intensity

图3表明：当鲁米诺浓度大于6.0×10-4mol/L，体系化学发光强度较大且基本保持稳定，实验选取鲁米诺浓度为7.0×10-4mol/L。

2.1.4 试剂混合方法和放置时间的影响

考察鲁米诺与氢氧化钠混合溶液、过氧化氢与氢氧化钠混合溶液两种不同混合方法对体系化学发光强度的影响。在相同条件下测定，结果表明过氧化氢与氢氧化钠混合溶液对同浓度鲁米诺溶液的相对化学发光值较大且稳定。

当混合液中氢氧化钠浓度0.10mol/L，过氧化氢浓度0.050mol/L时，在鲁米诺浓度7.0×10-4mol/L条件下，按2.1.1节仪器工作参数运行，考察混合溶液混合放置5～25min时，放置时间对化学发光强度的影响，结果表明：混合时间为12min时化学发光强度最大且稳定。

2.1.5 过氧化氢浓度的选择

氢氧化钠浓度为0.10mol/L、鲁米诺浓度为7.0×10-4mol/L，混合12min，按2.1.1节仪器工作参数实验，考察过氧化氢浓度在0.01～0.30mol/L范围内对化学发光强度的影响，见图4。

图4 过氧化氢浓度对相对化学发光强度的影响Fig.4 Effect of hydrogen peroxide concentration on relative luminescence intensity

图4表明：过氧化氢浓度为0.15～0.30mol/L时，体系化学发光强度较大且基本稳定，实验选择过氧化氢浓度为0.20mol/L。

2.2 洗脱液用量的确定

按照1.3.2节中固相萃取柱的操作方法，用体积比1:19的氨水-甲醇混合溶液4.00mL，以10～15滴/min流速洗脱，定量收集洗脱液后，另取3.00mL相同的氨水+甲醇混合溶液再继续洗脱时没有测定信号，表明用4.00mL洗脱液即可以洗脱完全。

2.3 干扰实验

在优化实验条件下，对1.00×10-7mg/mL盐酸二氟沙星进行干扰实验，在相对误差±5%范围内，100倍K+、Na+、Mg2+、SO42－、Cl－；50 倍 Ca2+、Fe2+、NO3－均不产生干扰。

2.4 相关系数、检出限和定量限

优化实验条件下，按1.3.1节方法以盐酸二氟沙星质量浓度的负对数为横坐标，相对化学发光强度差值ΔI=I0－I标为纵坐标，绘制标准曲线可知，盐酸二氟沙星质量浓度在1.00×10-5～1.00×10-9mg/mL实验范围内，质量浓度的负对数与化学发光强度有良好线性关系，线性方程为y＝－24.4x＋245.3，相关系数r为0.9956。对空白溶液进行11次平行测定的检出限(RSN＝3)为4.07×10-9mg/mL，平行测定的RSD为0.93%，定量限(RSN＝10)为1.36×10-8mg/mL。

2.5 测定结果及回收率

在优化实验条件下，样品按1.3.2节处理后上机测定，于5min内可完成分析，测定结果以平均值报告，同时进行加标回收率实验，结果见表2。

表2 样品测定结果及回收率Table 2 Recovery rates of difloxacin hydrochloride from spiked positive pork and chicken liver samples

由表2可知，猪肝和鸡肝样品均未检出盐酸二氟沙星，加标回收率分别为59.00%～78.63%和52.50%～72.63%。标准加入量为同一个数量级时，化学发光法与液质联用法测定氟喹诺酮类药物的加标回收率51.4%～72.5%相一致[21]。

3 结 论

在氢氧化钠碱性介质中，过氧化氢氧化鲁米诺产生化学发光，微量盐酸二氟沙星能有效抑制相对化学发光强度。通过对测定条件的优化，建立了鲁米诺-过氧化氢化学发光体系测定动物组织中盐酸二氟沙星的新型分析方法，用于测定猪肝中盐酸二氟沙星的加标回收率达78.63%，测定鸡肝中盐酸二氟沙星的加标回收率达72.63%，检出限为4.07×10-9mg/mL，定量限为1.36×10-8mg/mL，该法仪器简单、操作简便、成本低廉，具有快速、灵敏、准确、成本低廉的显著优点，有较好的推广应用价值。

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Determination of Difloxacin Hydrochloride Residue in Animal Liver by Solid Phase Extraction and Flow Injection Chemiluminescence

ZHU Ying-rui，GAO Xiang-yang*，ZHAO Chen
(College of Food Science and Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

A new quick method for the determination of difloxacin hydrochloride residue in pork and chicken livers using solid phase extraction followed by flow injection chemiluminescence analysis was presented based on the inhibition of chemiluminescence generation from the reaction between luminol and hydrogen peroxide by difloxacin hydrochloride. The results showed that an excellent linear relationship between chemiluminescence intensity and negative logarithm of difloxacin hydrochloride concentration was observed in the range of 1.00 × 10-5－1.00×10-9mg/mL. The limit of detection for difloxacin hydrochloride was 4.07 × 10-9mg/mL. The precision was 0.93% (relative standard deviation, RSD) for eleven replicate determinations. Therefore,this method can be used for the determination of difloxacin hydrochloride in animal liver with satisfactory results.

difloxacin hydrochloride；flow injection chemiluminescence；animal liver；solid phase extraction

O657.3；R917

A

1002-6630(2012)16-0184-04

2012-02-20

河南省重点学科建设基金项目(10466-X-082301)

朱盈蕊(1986—)，女，硕士研究生，主要从事食品安全、现代食品分析技术研究。E-mail：zhuyanan521 @163.com

*通信作者：高向阳(1949—)，男，教授，主要从事食品分析、食品资源开发研究。E-mail：ndgaoxy@163.com