基于近红外光谱对牛奶中掺杂尿素的判别分析

杨仁杰，刘 蓉*，徐可欣

(1.天津大学 精密测试技术及仪器国家重点实验室，天津 300072；2.天津农学院机电工程系，天津 300384)

基于近红外光谱对牛奶中掺杂尿素的判别分析

杨仁杰1,2，刘 蓉1,*，徐可欣1

(1.天津大学 精密测试技术及仪器国家重点实验室，天津 300072；2.天津农学院机电工程系，天津 300384)

采集40个合格的纯牛奶样品，并配制含有尿素为1～20g/L的40个牛奶样品，研究掺杂尿素牛奶的二维相关近红外特性，在此基础上选择波数4200～4800cm-1为建模区间，采用偏最小二乘法建立定性、定量模型。结果指出通过判别偏最小二乘法可以实现纯牛奶及掺杂尿素牛奶的定性鉴别，判别正确率为100%；掺杂牛奶校正集相关系数R为0.999，交叉验证均方差为0.242，对未知样品集预测相关系数R达到0.999，预测标准偏差为0.57，这表明所建模型具有较好的预测效果。

近红外光谱；牛奶；尿素；掺杂；偏最小二乘判别分析法

众所周知，牛奶具有较高的营养价值，其中含有促进人体生长发育及维持健康水平的必需营养成分，如蛋白质、脂肪、乳糖和其他固形物等。随着人们生活水平的提高，奶制品在国内的消费量迅速增加。在巨大经济利益的驱使下，乳品掺假现象也越来越严重。市场上曾经出现“阜阳奶粉事件”、“还原奶事件”、“光明牛奶回奶事件”、“雀巢奶粉事件”，以及更加严重的“三聚氰胺事件”，这些事件都说明了牛奶质量控制的重要性和紧迫性。

尿素是蛋白质代谢产物，少量存在于哺乳动物的乳汁中。一般认为尿素含量介于0.2～0.3g/L为牛奶的正常含量范围[1]。目前一些不法商贩为了达到以次充好、赚取非法利润的目的，在牛奶中添加尿素以提高蛋白质含量，直接危害人体健康，导致潜在危险或中毒，同时给乳品加工企业造成巨大的经济损失。

目前，对牛奶中尿素的快速检测方法有比色测定法、p H值差异测定法、酶与选择性电极联用等分析方法。上述方法适合常规检测，但操作复杂、耗时较多，不适合于原料奶收购中及时的质量控制[2]。近红外光谱分析技术具有无需对样品处理、成本低、对样品无损检测等特点，适合对乳制品中掺杂物质的检测[3-9]。本实验在研究掺杂尿素牛奶二维近红外相关谱特性基础上，选择最佳建模波数区间，建立定性、定量分析牛奶中掺杂尿素的判别模型，这对于维护乳制品市场稳定，保护消费者利益具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

为了避免不同品牌牛奶之间存在的差异性，分别采用3个品牌的牛奶进行对比实验，掺杂目标物尿素由中国医药(集团)上海化学试剂公司提供。分别配制尿素质量浓度最低为1g/L，最高为20g/L的40个样品。用浓度梯度法从掺有尿素的牛奶样品中选出28个样品作为校正集，余下12个作为预测集。并随机选择40个纯牛奶样品中的28个作为校正集，其余12个组成独立预测集。

Spectrum GX傅里叶变换红外光谱仪(带液氮冷却的InGaAs检测器) 美国PerkinElmer公司；FA25型高剪切分散乳化机 美国Fluko公司。

1.2 方法

1.2.1 PLS-DA分析

偏最小二乘判别分析方法(partial least squares discriminant analysis，PLSDA)是基于偏最小二乘回归的一种判别算法。PLSDA将回归分析中的Y变量设定为类别变量，用类别变量和光谱矩阵进行线性回归，其基本判别过程如下：1)建立训练集样本的类别变量；2)用类别变量与光谱矩阵进行PLS分析，建立类别变量与光谱数据间的PLS回归模型；3)根据训练集样本建立的PLS模型，计算未知样本类别变量的预测值Ypred，当Ypred＞0.5，且偏差＜0.5时，判定样本属于该类；当Ypred＜0.5，偏差＜0.5时，判定样本不属于该类；当Ypred的偏差≥0.5时，判别不稳定[10]。

1.2.2 偏最小二乘分析

利用Unscrambler分析程序，对输入的掺杂牛奶光谱数据进行多元散射校正，使用Savitzky-Golay7点平滑方法计算二阶导数光谱，并标准正交变换(standard nomal variate，SNV)后用PLS计算程序进行运算。利用交互验证(cross-validation)的方法来确定模型的最佳主成分数，利用测定值与模型计算值之间的建模相关系数(R)，内部交叉验证均方差(root mean square errors of cross validation，RMSECV)，预测相关系数(R)，预测均方差(root mean square errors of prediction，RMSEP)等指标评定模型的质量。

1.2.3 实验操作

实验仪器参数：光源为仪器自带的卤素灯，分辨率为4cm-1，扫描范围为4000～10000cm-1，扫描间隔为8cm-1，扫描次数为8。

实验前，对所配制的掺杂尿素牛奶进行均质。为了减少随机误差，测量时，随机抽取样品进行光谱数据采集，且每个样品扫描8次取平均值。

2 结果与分析

2.1 建模波段的选择

图1 纯牛奶与掺杂尿素牛奶的近红外光谱图Fig.1 Near-infrared spectra of pure milk and adulterated milk

由图1可知，整个光谱范围内纯牛奶样品与掺杂尿素牛奶样品的光谱形状，谱峰位置几乎相同，看不出关于掺杂目标物尿素任何信息，表明简单的通过光谱形状和谱峰位置很难判别牛奶中是否掺杂尿素。

光谱范围对建立模型的性能和预测准确性有很大的影响，所以最理想建模区间应该选在测量目标物特征信息波段，且该波段不受样品中其他物质的干扰，或者说选择随着待测目标物质量浓度变化大的波数区间。使用2Dshige软件(由日本Kwansei Gakuin大学Daisuke Adachi所编写)进行相关运算，得到二维近红外相关图。建立在二阶导数谱基础上，以牛奶中掺杂尿素质量浓度为外绕构建二维相关近红外谱。在整个近红外波数区间内，随着牛奶中掺杂目标物尿素质量浓度的变化，其光谱信息变化主要发生在4200～4800cm-1区间。

图2 掺杂尿素牛奶同步二维相关近红外谱图Fig.2 Synchronous 2D near-infrared correlation spectrum of milk adulterated with urea

由图2可知，在4200～4800cm-1区间的自相关峰与尿素在这一区域存在吸收峰一致[11-14]，因此选择4200～4800cm-1为建模区间。

2.2 PLS-DA判别模型的建立与验证

PLS判别分析中，Y变量为类别变量，对于两类判别，掺杂样品和纯牛奶的Y变量值分别设定为1和0。异常样本会影响模型的稳健性和预测精度。本研究根据样本在主成分得分散点图上的分布，剔除1个异常样品。对校正集中剩余的55个样品，采用PLS-DA法建立判别模型，图3描述了所有校正集中纯牛奶样本与掺杂尿素牛奶样本分类变量的PLS预测值与实测值之间的关系。从图3可以看出，分散在Ypred＝0.5线以下的都为纯牛奶样本，分布在Ypred＝0.5线以上的都是掺杂尿素牛奶样本，其中有一个掺杂尿素牛奶样本(1g/L)处在Ypred＝0.5线以下，被误判为纯牛奶样本。

图3 校正集纯牛奶与掺杂尿素牛奶判别结果Fig.3 Discrimination results of pure milk and adulterated milk by PLS-DA model

利用PLS-DA分析方法建立牛奶掺杂判别模型，对未参与建模的24个独立预测集样本(12个纯牛奶样本和12个掺杂尿素牛奶样本)进行分析，结果见表1。显然，利用PLS-DA所见模型可以实现对所有预测集样本的正确判别，对掺杂牛奶和纯牛奶的判别率为100%。

表1 PLS-DA模型对预测集样品判定结果Table 1 Discrimination results of samples in prediction set by PLS-DA method

2.3 牛奶中尿素含量定量检测模型的建立

在完成准确的定性判别之后，还对40个掺假牛奶样品进行了定量分析。

采用化学计量学软件Unscrambler偏最小二乘法建立测定牛奶中尿素含量的数学模型。为了评价模型的稳定性和拟合效果，对模型进行内部交互验证。图4是牛奶中尿素含量实测值(C实测)与预测值(C预测)之间关系的线性拟合，其拟合方程为C预测＝0.016＋0.998C实测，相关系数R为0.999，内部交叉验证均方差(RMSECV)为0.242g/L，说明所建模型的稳定性和拟合效果非常好。

图4 校正集样本预测值和实际值之间关系Fig.4 Relationship between actual values and predicted values of urea content in calibration set

根据上述所建PLS模型，采用外部验证方法对所建模型实际预测效果进行评价。图5是采用模型对独立的预测集样品的预测结果(C预测)与实测结果(C实测)之间关系的线性拟合。预测值与实测值之间的相对误差较小，最小接近0，最大为8%，平均相对误差为1.89%，拟合方程为C预测＝0.02＋1.009C实测，相关系数R为0.999，预测标准偏差为0.57g/L。

图5 预测集样本预测值和实测值之间关系Fig.5 Relationship between actual values and predicted values of urea content in prediction set

3 结 论

应用PLS-DA法建立对牛奶中掺杂尿素分析的定性、定量模型，具有较好的预测效果，对未知样品集的判别准确率为100%，预测值非常接近实测值，其相关系数都超过了0.99。该方法简单、快速，为实现快速检测牛奶中掺杂物提供了实验基础。

[1] 赵旭博, 董文宾, 王顺民, 等. 国外牛奶中尿素含量检测新进展[J].食品研究与开发, 2004, 15(6): 109-113.

[2] 唐玉莲. 近红外光谱在乳制品成分快速检测方面的应用研究[J]. 乳业科学与技术, 2009, 32(4): 190-194.

[3] HE Bin, LIU Rong, YANG Renjie, et al. Adulteration detection in milk using infrared spectroscopy combined with two-dimensional correlation analysis[C]//GERARD L C. Optical diagnostics and sensing X: toward point-of-care diagnostics. San Jose, USA: Proc of SPIE, 2010: 75720-57207.

[4] KASEMSUMARAN S, THANAPASE W, KIATSOONTHON A. Feasibility of near infrared spectroscopy to detect and to quantify adulterants in cow milk[J]. Analytical Sciences, 2007, 23(7): 907-910.

[5] 董一威, 屠振华, 朱大洲, 等. 利用近红外光谱快速检测牛奶中三聚氰胺的可行性研究[J]. 光谱学与光谱分析, 2009, 29(11): 2934-2938.

[6] 王小燕, 王锡昌, 刘源, 等. 近红外光谱技术在食品掺伪检测应用中的研究进展[J]. 食品科学, 2011, 32(1): 265-269.

[7] 袁石林, 何勇, 马天云, 等. 牛奶中三聚氰胺的可见/近红外光谱快速判别分析方法的研究[J]. 光谱学与光谱分析, 2009, 29(11): 2939-2942.

[8] LU Chenghui, XING Bingren, HAO Gang, et al. Rapid detection of melamine in milk powder by near infrared spectroscopy[J]. J Near Infrared Spectroscopy, 2009, 17(2): 59-67.

[9] MAUER L J, CHERNYSHOVA A A, HIATT A, et al. Melamine detection in infant formula powder using near- and mid-infrared spectroscopy[J]. J Agric Food Chem, 2009, 57(10): 3974-3980.

[10] 杨忠, 任海清, 江泽慧. PLS-DA法判别分析木材生物腐朽的研究[J].光谱学与光谱分析, 2008, 28(4): 793-796.

[11] OLESBERG J T, ARNOLD M A, FLANIGAN M J, et al. Online measurement of urea concentration in spent dialysate during hemodialysis[J]. Clin Chem, 2004, 50(1): 175-181.

[12] EDDY C V, FLANIGAN M, ARNOLD M A. Near-infrared spectroscopic measurement of urea in dialysate samples collected during hemodialysis treatments[J]. Applied Spectroscopy, 2003, 57(10): 1230-1235.

[13] DESSIPRIA E, MINOPOULOUB E, CHRYSSIKOS G D, et al. Use of FT-NIR spectroscopy for on-line monitoring of formaldehyde-based resin synthesis[J]. European Polymer Journal, 2003, 39(8): 1533-1540.

[14] OLESBERG J T, ARNOLD M A, FLANIGAN M J. Online measurement of urea concentration in spent dialysate during hemodialysis[J].Clinical Chemistry, 2004, 50(1): 175-181.

Discrimination of Milk Adulteration with Urea Based on Near Infrared Spectroscopy

YANG Ren-jie1,2，LIU Rong1,*，XU Ke-xin1
(1. State Key Laboratory of Precision Measuring Technology and Instruments, Tianjin University, Tianjin 300072, China；2. Department of Electromechanical Engineering, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China)

Forty eligible pure milk samples were collected and 40 adulterated milk samples were prepared by adding urea with various concentrations (1－20 g/L). Two-dimensional correlation spectroscopy was calculated under the perturbation of adulteration. Based on the 2D correlation infrared spectroscopic characteristics, the spectra in the range of 4200－4800 cm-1were selected for quantitative and qualitative by partial least squares. There results showed that a 100% recognition rate of samples was achieved by partial least square-discriminate analysis (PLS-DA). The correlation coefficient (R) of calibration sets was 0.999, and the root mean square errors of cross validation (RMSECV) were 0.242. The R between the predicted values and actual values was 0.999, and the root mean square errors of prediction (RMSEP) were 0.57. Therefore, the developed models have good prediction capacity.

near-infrared spectroscopy；milk；urea；adulteration；partial least square-discriminate analysis

O657.33

A

1002-6630(2012)16-0120-04

2011-07-20

国家自然科学基金重点项目(60938002)；国家自然科学基金青年科学基金项目(30900275)；教育部高等学校博士学科点科研基金专项(20090032120064)

杨仁杰(1978—)，男，博士研究生，主要从事光谱检测技术研究。E-mail：rjyang1978@163.com