二色补血草多糖铁(Ⅲ)配合物的制备及理化性质研究

李 琳，李稳宏,*，雒 羽，赵 鹏，雷雨辰，滕家辉，马 伟

(1.西北大学化工学院，陕西 西安 710069；2陕西中医学院药学院，陕西 咸阳 712046；3.中国科学院大连化学物理研究所，分子反应动力学国家重点实验室，辽宁 大连 116023)

二色补血草多糖铁(Ⅲ)配合物的制备及理化性质研究

李 琳1，李稳宏1,*，雒 羽1，赵 鹏2,3，雷雨辰1，滕家辉1，马 伟1

(1.西北大学化工学院，陕西 西安 710069；2陕西中医学院药学院，陕西 咸阳 712046；3.中国科学院大连化学物理研究所，分子反应动力学国家重点实验室，辽宁 大连 116023)

目的：研究二色补血草多糖铁(Ⅲ)配合物(LPC)的最佳合成工艺及其理化性质。方法：采用响应面分析法对LPC合成条件进行优化，并根据LPC的水解及还原性实验判断其在生理条件下的稳定性。结果：LPC的最佳合成工艺为水浴温度73℃、多糖与柠檬酸三钠的质量配比5:1、反应液pH8，且理化性质稳定。结论：LPC具有较好的理化性质，有望开发成为一种新型的补铁剂。

二色补血草；多糖铁配合物；响应面分析方法；理化性质

二色补血草(Limonium bicolor)为蓝雪科(Plumba ginaceae)补血草属的多年生草本植物，别名苍蝇花、蝇子草，主要分布于我国陕西、河北、山西、甘肃等地。二色补血草可全草入药，性味甘、微涩苦、无毒。主要功效为补血、止血、散瘀、调经、益脾、健胃等[1-2]，主治崩漏、尿血、月经不调等症[3-4]。近年来研究发现，多糖铁(Ⅲ)配合物作为补铁剂不仅具有合适的配合稳定性，对胃肠道无或甚少刺激作用，而且当其释放铁之后，配体多糖具有多方面的生物活性，是对肌体有益的成分，不会产生毒副作用[5-8]。

鉴于二色补血草本身所具有的补血功能，本研究利用其为原料，从中提取二色补血草多糖，与铁(Ⅲ)进行络合反应，探讨制备二色补血草多糖铁(Ⅲ)配合物的工艺路线，并对该配合物理化性质进行初步研究，为将二色补血草多糖铁(Ⅲ)配合物开发成为一种营养型口服补铁剂打下一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

二色补血草 西安万寿路中药材批发市场；柠檬酸三钠、三氯化铁、氢氧化钠、硫酸亚铁、K4[Fe(CN)6]、乙醇、乙醚、丙酮、氯仿、正丁醇等均为分析纯；LS-206型大孔树脂 西安蓝晓科技新材料股份有限公司；实验用水为双蒸水。

AL204型分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；UV-2401紫外-可见分光光度计、S7-AA-7000型原子吸收光谱仪 日本岛津公司；DZF-602真空干燥箱上海申贤恒温设备厂；RE-52AA旋转蒸发仪 上海嘉鹏科技有限公司；TGL-16C型高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂；PHS-2C酸度计 上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 二色补血草多糖的制备

用95%乙醇对二色补血草进行脱脂，将脱脂后的药材置于圆底烧瓶中按一定的料液比加入蒸馏水，在热水中浸提，趁热抽滤，浓缩，加入一定量的无水乙醇醇沉，静置得二色补血草粗多糖沉淀。后将粗多糖溶于水，用Sevag法除蛋白后，经过LS-206型大孔树脂进行脱色，浓缩，醇沉，静置，过滤，沉淀依次用乙醇、丙酮抽洗，真空干燥，得二色补血草多糖白色无定形粉末。经过苯酚-硫酸法[9]测得多糖含量为48.9%。

1.2.2 LPC的合成工艺

称取二色补血草纯化多糖适量，柠檬酸三钠0.5g，置于史莱克管中，溶于少量水中，置水浴中加热并不断搅拌。在不断搅拌的过程中，同时缓缓交替滴加2mol/L三氯化铁溶液和20%氢氧化钠溶液，控制溶液的pH8.0～8.5。当反应液中出现棕红色不溶性沉淀时，立即停止滴加FeCl3和NaOH溶液，继续在热水浴中搅拌1h。反应液冷却后，3500r/min离心15min。弃去沉淀，收集离心液。离心液中加入3倍量的无水乙醇，搅拌均匀，静置后过滤，滤饼分别用甲醇、9 5%乙醇、无水乙醇、乙醚洗涤，真空干燥，得棕褐色二色补血草铁(Ⅲ)粗品，后再对其进行透析纯化，去除粗品中的小分子杂质，得二色补血草铁(Ⅲ)。工艺流程见图1。铁含量的测定采用邻菲罗啉分光光度法测定[10]。

图1 二色补血草多糖铁合成工艺流程图Fig.1 Flow chart of LPC preparation process

1.2.3 二色补血草多糖铁(Ⅲ)配合物制备工艺优化

依据Box-Behnken试验设计原理，在前期单因素试验的基础之上，选取水浴温度、多糖与柠檬酸三钠配比、pH值3个因素进行响应面优化试验。响应面试验因素与水平见表1。

表1 二色补血草多糖铁(Ⅲ)配合物制备工艺优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.4 产品LPC中铁含量测定[13]

采用GB 11911—1989《水质 铁、锰的测定：火焰原子吸收分光光度法》测定LPC中铁的含量。原子吸收光谱条件：在50B原子吸收光谱仪上，用火焰法，在灯电流5.0mA、狭缝0.5nm、波长248.3nm、火焰高度7.5mm、空气流6.5L/min、乙炔流量1.5L/min。

1.2.5 产品LPC理化性质测定

1.2.5.1 产品LPC一般物理性质测定

考察产品LPC的溶解性、熔点、溶液pH值等一般物理性质，透析除盐后的LPC溶于水，以K4[Fe(CN)6]检验其水溶液，检测Fe(Ⅲ)离子的特殊显色效应。

1.2.5.2 产品LPC的水解实验

补铁剂在铁吸收的主要部位——十二指肠是否可溶，是补铁剂生物利用度高低的关键之一。对LPC、三氯化铁、硫酸亚铁3种含铁剂进行水解实验，观察它们在不同pH值时的稳定情况。

配制含铁浓度均为0.01mol/L的LPC、三氯化铁、硫酸亚铁溶液，各精密量取20mL，用0.01mol/L的氢氧化钠标准溶液分别滴定；同时用测定反应溶液pH值变化情况。

1.2.5.3 产品LPC的还原性实验

采用邻菲罗啉比色法对LPC进行还原性实验，其基本原理为：在酸性条件下以抗坏血酸为还原剂，将多糖铁中的三价铁离子还原为二价，二价铁离子与邻菲罗啉生成一种红色螯合物，根据其颜色的深浅得出溶液中铁含量的高低。

量取1mmol/L的LPC溶液5.0mL，分别置于8个50mL容量瓶中，控制p H值分别为1、2、3、4、5、6、7、8，再分别加入10%抗坏血酸溶液1.0mL，0.12%邻菲罗啉试剂5.0mL，定容至刻度，恒温37℃水浴条件下还原，取不同时间点的反应溶液于510nm波长处测定吸光度，考察产品LPC的还原性，以不加LPC溶液作为空白。

2 结果与分析

2.1 二色补血草多糖铁(Ⅲ)配合物制备工艺条件优化

2.1.1 响应面试验结果及拟合模型

响应面面试验设计及结果见表2，方差分析见表3。

表2 二色补血草多糖铁(Ⅲ)配合物制备工艺优化响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis for Fe content of LPC with various extraction conditions

从表3可以看出，模型的显著性F＝40.10＞0.05，r＝223.36/227.69＝0.9810，显著性水平P＜0.001，表明模型显著，此外模型方程失拟项很小，可认为方程对试验结果拟合情况较好，试验误差小，因此能够对实验的结果进行分析预测[11-12]。从方差分析表可以看出，反应液pH值对提取影响最为显著，其次是柠檬酸三钠的质量配比和水浴温度。方程的一次、二次项显著性水平P＜0.05，影响显著，说明各个试验的因子对响应值的影响并非为线性关系。经对各因素回归拟合后，得到回归方程为：

2.1.2 等高线图和响应面图分析

利用Design Expert软件对二次回归方程优化响应面及等高线图见图2。

图2 各两因素交互作用对LPC铁含量影响的响应面及等高线图Fig.2 Response surface and contour plots for the effects of synthesis conditions on Fe content of LPC

由图2可知，反应液pH值的影响最为显著，曲面较陡；柠檬酸三钠的质量配比和水浴温度次之，二者的曲面相对平滑一些。由回归方程得到的优化合成工艺条件为：水浴温度72.8℃、多糖与柠檬酸三钠的质量配比4.68:1、反应液pH8.15。回归模型预测在此二色补血草多糖铁合成最佳工艺条件下，多糖铁中铁含量为20.7774%。

按照最优工艺条件进行验证实验，考虑到实验的可操作性，将最优工艺条件修正为水浴温度73℃、多糖与柠檬酸三钠质量配比5:1、反应液pH8，通过3次平行验证实验得到二色补血草多糖铁中平均铁含量为20.48%，与理论预测值吻合良好，说明应用响应面优化法得到的优化工艺参数是准确可靠的。

2.2 产品LPC的铁含量

产品LPC中铁含量测定结果为20.27%，此结果表明：用邻菲罗啉分光光度法测定LPC中铁含量的方法简捷快速，精密度高，铁含量测定结果与原子吸收光谱法测定结果一致。

2.3 LPC的理化性质

2.3.1 LPC的一般物理性质

LPC是无定形棕褐色粉末，无臭、无味，易溶于水，其水溶液呈中性，有丁达尔现象，不溶于无水乙醇、无水甲醇、乙醚等有机溶剂。熔点高于3 0 0℃。透析除盐后的LPC溶于水，以K4[Fe(CN)6]检验其水溶液，结果不显示Fe(Ⅲ)离子的特殊显色效应。证实LPC水溶液中不存在游离的Fe3+，说明生成了较为稳定的配合物。

2.3.2 LPC的水解实验[14]

图3 三种含铁剂的NaOH滴定曲线Fig.3 NaOH titration curves of three kinds of iron supplements

由图5可知，FeCl3开始浑浊时的pH2.64，出现大量浑浊时的pH6.71。FeSO4开始浑浊时的pH3.32，出现大量浑浊时的pH6.78。LPC在pH12时仍无浑浊。但是，当pH值逐渐减小至3.5时，LPC开始出现沉淀，并且pH值越小沉淀量越大。说明LPC在pH3.5～10.5范围内具有特别的稳定性，在强酸条件下LPC的结构被破坏，生成了不溶物。

2.3.3 LPC的还原性实验[15]

图4 二色补血草多糖铁与抗坏血酸反应体系的A-t曲线Fig.4 A-t curves of the reaction system between LPC and vitamin C

由图4可知，LPC中的铁可以被还原剂还原，30min内几乎可以全部溶出，溶出率达到100%。可见LPC有良好的溶出被还原性能，可以说明LPC作为口服补铁剂可被食物中的某些还原性物质将其中的三价铁还原成二价铁，进而被机体吸收利用，有较好的生物利用度，由于没有游离的Fe3+存在，所以LPC对消化道无明显的刺激作用。

3 讨 论

3.1 本实验以二色补血草为原料，在单因素试验的基础上采用响应面法对其合成多糖铁工艺条件进行优化，得到合成LPC最佳工艺为水浴温度73℃、多糖与柠檬酸三钠的质量配比5:1、反应液pH8。

3.2 产品LPC的铁含量实验结果表明：邻菲罗啉分光光度法测定LPC中铁含量的方法简捷快速，精密度高，铁含量测定结果与原子吸收光谱法测定结果吻合良好。

3.3 LPC溶于水呈深红棕色透明溶液，有丁达尔现象，说明LPC和氢氧化铁溶液一样，也是一种胶体溶液。据观察，这种胶体溶液相当稳定，长期放置不发生聚沉，颜色均一且透明。

3.4 口服补铁剂的主要吸收部位是在十二指肠(pH6～7)，要求补铁剂具有可溶性，并以此作为判断补铁剂生物利用度高低的主要指标。由图3、4可以看出LPC在生理pH条件下可溶且能够稳定存在，但作为口服补铁剂不宜空腹服用(空腹时，胃液pH＜3)，并且三价铁在pH1～8范围内能够较迅速的还原成二价铁，说明LPC若作为补铁剂可被食物中的还原性物质(抗坏血酸)将三价铁还原成二价铁后被机体吸收，有较好的生物利用度，又因溶液中无游离的Fe3+存在，所以应无明显的消化道刺激作用。

[1] 吴冬青, 安红钢, 林敏, 等. 二色补血草不同部位总黄酮含量的测定[J]. 光谱实验室, 2006, 23(1): 127-129.

[2] 张连茹, 邹国林, 杨天鸣. 麻黄水溶性多糖的提取及其清除氧自由基作用的研究[J]. 氨基酸和生物资源, 2000, 22(3): 65-67.

[3] SAS G, NEMESASZKY E, BRAUER H. On the therapcutic effects of trivalent and divalent iron deficiency anemia[J]. Arznelm-Forsch/Drug Res, 1984, 34(1): 1575-1579.

[4] ZHUSUPOVA G E, ARTAMONOVA N A, ABILOV Z A, et al. Lipophilic pigments and fatty acids from theaerial parts of certain plant species of the genusLimonium.Ⅶ[J]. Chemistry of Natural Compounds,2006, 42(5): 512-514.

[5] ANIYA Y, MIYAGI C, NAKANDAKARI A, et al. Free radical scavenging action of the medicinalherbLimonium wrightiifrom the Okinawa islands[J]. Phytomedicine, 2002, 9(3): 239-244.

[6] TANG X H, GAO J, CHEN J, et al. Mitochondrial modulation is involved in the hepatoprotection ofLmionium sinenseextractagainst liverdamage inmice[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2008, 120(3): 427-431.

[7] 王耀莉, 史锁洪, 朱霖, 等. 多糖铁复合物治疗儿童缺铁性贫血[J].新药与临床, 1994, 13(4): 251-252.

[8] 杨真, 岁海古. 缺铁性贫血及补铁剂研究进展[J]. 国外医学卫生学分册, 2006, 33(2): 90-93.

[9] 张惟杰. 糖复合物生化研究技术[M]. 2版. 杭州: 浙江大学出版社,1997: 11.

[10] 李玉贤, 游志恒, 褚意新. 百合多糖铁复合物的合成及其铁含量的测定[J]. 中国实验方剂学杂志, 2010, 16(7): 47-49.

[11] 崔易, 李稳宏, 唐璇, 等. 胭脂虫红色素提取工艺优化研究[J]. 化学工程, 2007, 35(6): 66-69.

[12] 刘军海, 任惠兰, 官波, 等. 响应面分析法优化白术多糖提取工艺[J].中成药, 2008, 30(5): 667-690.

[13] 国家环境保护局. GB 11911—1989 水质铁、锰的测定: 火焰原子吸收分光光度法[S]. 北京: 中国标准出版社, 1989.

[14] 王凯平, 张玉, 戴立泉. 当归多糖铁理化性质的初步研究[J]. 中国中药杂志, 2006, 31(9): 747-750.

[15] 李玉贤, 裴晓红. 大枣多糖铁(Ⅲ)配合物的合成及一般性质研究[J].中成药, 2006, 28(5): 707-709.

Synthesis and Physicochemical Properties ofLimonium bicolorPolysaccharide-Fe (Ⅲ) Complex

LI Lin1，LI Wen-hong1,*，LUO Yu1，ZHAO Peng2,3，LEI Yu-chen1，TENG Jia-hui1，MA Wei1
(1. College of Chemistry Engineering, Northwest University, Xi’an 710069, China；2. College of Pharmacy, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China；3. State Key Laboratory of Molecular Reaction Dynamics, Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China)

Objective: To explore the best synthetic process ofLimonium bicolorpolysaccharide-Fe (III) complex (LPC) and its physical and chemical properties. Methods: The synthetic process conditions were optimized by response surface methodology.The stability of LPC under physiological conditions was evaluated by its hydrolysis characteristics and reducibleness. Results: The optimal synthetic conditions were water bath temperature of 73℃, polysaccharides-to-C6H5Na3O7·2H2O ratio of 5:1 and reaction pH of 8. The prepared LPC was stable under physiological pH environment. Conclusion: LPC has excellent physicochemical properties and can be used as a new iron supplement.

Limonium bicolor；polysaccharide-Fe (Ⅲ)；response surface methodology；physicochemical properties

R284.1

A

1002-6630(2012)16-0054-05

2011-06-16

陕西省教育厅专项(2010JK521)

李琳(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为天然药用活性成分分离纯化。E-mail：lilinsidan@sina.com

*通信作者：李稳宏(1950—)，男，教授，研究方向为天然生物提取、分离与纯化。E-mail：liwenhong@nwu.edu.cn