响应面法优化超声波辅助提取仿栗籽油工艺及其脂肪酸组成分析

麻成金，黄 伟，黄 群，吴竹青，吴丽雅

(1.吉首大学 林产化工工程湖南省重点实验室，湖南 张家界 427000；2.吉首大学食品科学研究所，湖南 吉首 416000)

响应面法优化超声波辅助提取仿栗籽油工艺及其脂肪酸组成分析

麻成金1,2，黄 伟2，黄 群2，吴竹青2，吴丽雅2

(1.吉首大学 林产化工工程湖南省重点实验室，湖南 张家界 427000；2.吉首大学食品科学研究所，湖南 吉首 416000)

采用超声波辅助提取仿栗籽油，通过单因素试验和响应面法(RSM)对提取工艺进行优化，并利用气相色谱-质谱联用法测定仿栗籽油的脂肪酸组成。结果表明，超声波辅助提取仿栗籽油的优化工艺条件为以环己烷为提取溶剂、超声工作/间歇时间为3s/1s、超声功率540W、超声时间18min、提取温度60℃、液料比8.6:1(g/mL)，在此工艺条件下，仿栗籽油提取率可达94.53%。气相色谱-质谱联用测定结果表明仿栗籽油中富含不饱和脂肪酸，总含量达到70.13%，其中油酸和亚油酸的含量分别为53.95%、16.18%。

仿栗籽油；超声波辅助提取；响应面分析；气相色谱-质谱联用分析；脂肪酸组成

仿栗(Sloanea hemsleyana(Ito) Rehd. et Wils)系杜英科猴欢喜属常绿乔木，在我国湖南、湖北、四川、云南、贵州及广西等省有广泛分布，其中以湖南西部分布最多[1]。仿栗产果量高，成年仿栗树每株可年产种籽15～20kg，仿栗籽含油率在49%～58%，可以用于制备高档食用油与生物柴油原料油，开发利用价值较高[2-3]。超声辅助提取技术是近年兴起来的一种油脂提取分离新技术，具有简便快捷、安全高效、易于实现工业化等优点[4-5]。响应面法(response surfacemethodology，RSM)是解决多变量问题的一种统计方法，利用合理的试验设计，采用多元二次回归方程来拟合响应值与因素之间的函数关系，然后通过对回归方程的分析来寻求最佳工艺参数，以较少试验次数和较短时间对所选的试验参数进行全面研究，在生物化工过程优化中有着广泛应用[6-7]。

目前，国内外对仿栗籽油研究报道较少，国内有人对压榨法、超临界流体法和超声波辅助法提取仿栗籽油进行了研究，胡欣欣等[3]通过正交试验设计对超声波辅助溶剂法提取仿栗籽油进行了研究，但其未考察超声波功率、超声工作时间/间歇时间等因素对仿栗籽油提取效果的影响。本试验探索仿栗籽油提取工艺，通过响应面法优化工艺参数，以求获得更高效的仿栗籽油提取技术参数，并对仿栗籽油的脂肪酸组成进行气相色谱-质谱联用分析，了解仿栗籽油的主要脂肪酸种类和含量，为开发仿栗籽资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

仿栗果实于2011年10月初采摘，风干取出种籽并分离种衣，干燥后粉碎过60目筛，密封保存供试验用，经测定粗脂肪含量为50.17%。

乙酸乙酯、丙酮、石油醚(沸程60～90℃)、环己烷、硫酸等为国产分析纯；甲醇、正己烷为色谱纯。

1.2 仪器与设备

JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；CDE-220E2多功能食品处理机 佛山市顺德区欧科电器有限公司；HH.S精密恒温水浴锅 江苏金坛市医疗仪器厂；GZX-9146MBE电热鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；JA2003电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司；7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent Technologies公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

仿栗籽→干燥→粉碎→过筛→超声波处理→抽滤分离→减压蒸馏→溶剂回收→干燥→仿栗籽油

1.3.2 仿栗籽油提取率计算

仿栗籽油脂含量测定采用索氏提取法，参考GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的测定》，计算仿栗籽油提取率。

1.3.3 单因素试验

每次试验称取仿栗籽粉末10g，分别对提取溶剂(乙酸乙酯、石油醚(沸程60～90℃)、环己烷、丙酮)，超声工作/间歇时间(s)(5/1、4/1、3/1、2/1、1/1、1/2)，超声功率(300、350、400、450、500、550、600W)，超声时间(5、10、15、20、25、30min)，提取温度(20、30、40、50、60、70℃)，液料比(3:1、5:1、7:1、9:1、11:1、13:1)进行单因素试验，考察各因素对油脂提取率的影响[7]。

1.3.4 响应面优化试验

在单因素试验基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，选取超声功率、超声时间、提取温度、液料比作为考察变量，采用四因素三水平的响应面分析法，以提取率为响应值，对超声波辅助提取仿栗籽油工艺条件进行优化[9-11]。

1.3.5 仿栗籽油的气相色谱-质谱联用分析

1.3.5.1 仿栗籽油甲酯化

称取所得仿栗籽油1mL置于圆底烧瓶，加入0.5mol/L的KOH-甲醇溶液10mL于70℃水浴加热60min，冷却后转入分液漏斗，加入20mL正己烷，摇均匀后静置分层，取出上清液，用蒸馏水洗涤2～3次，加入无水硫酸镁干燥脱水，最后4500r/min离心10min，取上层清液置于瓶中待测[5,8]。

1.3.5.2 气相色谱-质谱联用仪工作条件

气相色谱条件：Agilent 190191S-433型石英毛细管柱(325℃，30m×250μm，0.25μm)；载气为高纯氦气(99.999%)，柱前压69.8kPa，柱内载气流量2mL/min；100℃开始保持2min，以15℃/min升温到160℃，再以5℃/min升温到250℃保持5min；气化室温度300℃；样品进样量1μL；分流比50:1。

质谱条件：EI离子源温度230℃，溶剂延时4min，电子能量70eV，扫描范围30～500u，分辨率1000。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取溶剂的确定

本试验通过比较乙酸乙酯、丙酮、石油醚(沸程60～90℃)和环己烷4种溶剂对仿栗籽油提取率的影响来确定较佳提取溶剂。提取条件：超声工作/间歇时间2s/1s、超声功率450W、超声时间15min、提取温度50℃、液料比7:1，结果见图1。由图1可知，环己烷的提取效果最好，故选用环己烷作为超声波辅助提取仿栗籽油的提取溶剂。

图1 不同溶液剂对油脂提取率的影响Fig.1 Effect of extraction solvents on oil yield

2.1.2 超声工作/间歇时间的确定

以环己烷为提取溶剂，在超声功率450W、超声时间15min、提取温度50℃、液料比7:1的条件下，考察不同超声工作/间歇时间对提取率的影响，结果如图2所示。由图2可知，随着超声工作/间歇时间增加，提取率逐渐增大，到3s/1s后趋于平缓，这可能是由于超声波作用时间与超声次数拮抗作用的结果。故选择超声工作/间歇时间为3s/1s进行后续试验。

2.1.3 超声功率对油提取率的影响

超声时间15min、提取温度50℃、液料比7:1，不同超声功率对油提取率的影响如图3所示。

由图3可知，仿栗籽油提取率随超声功率增加逐渐增大，在500W时达最大，随后略有下降。这可能是因为对于一定的频率和发射面，超声功率过大，声压幅值过大，以至空化泡在声波压缩相内来不及发生崩溃，而影响空化效果[11]，故选取超声功率500W较适宜。

2.1.4 超声时间对油提取率的影响

超声功率450W、提取温度50℃、液料比7:1，不同超声时间对油脂提取率的影响如图4所示。由图4可知，提取率随超声时间的延长而增大，但提取时间超过15min后增长缓慢，因此提取时间选择15min为宜。

图4 超声时间对油脂提取率的影响Fig.4 Effect of total ultrasonic treatment time on oil yield

2.1.5 提取温度对油脂提取率的影响

超声功率450W、超声时间15min、液料比7:1，不同提取温度对油提取率的影响如图5所示。

图5 提取温度对油脂提取率的影响Fig.5 Effect of extraction temperature on oil yield

由图5可知，仿栗籽油提取率随着温度升高而增大，当温度达到6 0℃时，提取率最高，而后开始下降。这可能是因为温度过高，溶剂的挥发加快，减少了溶剂和仿栗籽粉之间的有效接触面，浸出过程难以稳定，从而造成提取率下降[12-13]，因此选择60℃为提取温度。

2.1.6 液料比对油提取率的影响

超声功率450W、提取温度50℃、超声时间15min，不同液料比对油提取率的影响如图6所示。

图6 液料比对油提取率的影响Fig.6 Effect of solid-to-liquid ratio on oil yield

由图6可知，仿栗籽油提取率随液料比的增加呈先增加后减少的趋势，在液料比为7:1(mL/g)时，提取率达到最大值。这是因为当原料量一定时，溶剂用量越大，体系渗透压越大，油脂越容易被提取出来，但如果液料比过大，会增加超声波破碎细胞的阻力，使细胞破碎程度下降，从而降低油脂的提取率[14-15]，故7:1(mL/g)为适宜的液料比。

2.2 响应面优化试验

2.2.1 模型的建立与显著性检验

根据Box-Behnken试验设计原理，依据上述单因素试验结果，选取超声功率(X1)、超声时间(X2)、提取温度(X3)和液料比(X4)4个因素，以仿栗籽油提取率(Y)为响应值，设计四因素三水平的Box-Behnken试验。试验因素水平见表1，试验设计方案及结果见表2。

表1 超声波辅助提取仿栗籽油工艺优化Box-Behnken试验因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

表2 超声波辅助提取仿栗籽油工艺优化Box-Behnken试验设计方案及结果Table 2 Box-Behnken design and corresponding experimental results

通过SAS软件对表2中试验结果进行回归拟合分析，经二次回归拟合后求得的回归方程为：

方差分析结果见表3。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis for the fitted regression model

从表4可知，回归决定系数R2＝0.9696，说明响应值的变化有96.96%来源于所选因素的变化，模型修正决定系数R2Adj＝0.9341，说明该模型能解释93.41%响应值的变化，回归方程的显著性检验极显著、失拟性检验不显著，说明回归方程的预测值与试验值非常吻合，故该模型可用于仿栗籽油超声波辅助提取试验的理论预测。从方差分析表中各因素的F值可以看出，各因素对油脂提取率影响大小顺序为液料比＞超声功率＞超声时间＞提取温度，且液料比、超声功率和超声时间对提取率影响达到了极显著水平。考察因素间交互作用，由表3可知，超声时间与液料比、提取温度的交互作用达到了极显著水平，与超声功率的交互作用达到了显著水平。

2.2.2 响应面分析与优化

根据回归方程，利用SAS 8.1软件作出交互作用显著双因素的曲面图和等高线图见图7，可以直观地预测响应值以及确定变量相互作用的关系[16]。由图7a可知，超声功率与超声时间交互作用显著，在超声功率一定时，提取率随超声时间的延长而先增加后减小，在超声功率较大时，随着超声时间的延长，提取率增加幅度较大，但超声功率过大、时间过长时，提取率反而降低，这可能是因为长时间的大功率超声导致脂肪分解而影响了提取率。由图7b可知，提取温度与超声时间交互作用极显著，提取温度较低时，提取率随着超声时间的延长，上升幅度较大，温度较高时，油提取率变化平缓，且长时间高温作用时，油脂提取率明显降低，这可能是因为高温导致提取溶剂挥发和油脂分解的结果。由图7c可知，液料比与超声时间交互作用极显著，当液料比较大时，较短的超声时间即可达到较高油提取率，增加幅度较大，这是因为液料比大、体系渗透压大，油脂溶出更快，故可在短时间内达到较好的提取效果。

为了精确计算最佳工艺参数，对回归方程式中4个自变量分别求偏导并使其等于0，解方程可得优化工艺参数：超声功率538.68W、超声时间18.08min、提取温度59.77℃、液料比8.57:1(mL/g)，在此优化工艺条件下，仿栗籽油的理论提取率可达95.48%。

图7 各两因素交互作用对仿栗籽油提取率影响的响应面及等高线图Fig.7 Response surface and contour plots for the interactive effects of four extraction parameters on oil yield

2.2.3 最佳工艺确定与验证实验

为检验响应面法优化仿栗籽油提取工艺的可靠性，对优化提取工艺条件进行验证实验，结果取3次平行试验的平均值。考虑到实际操作便利性，将优化工艺参数调整为：超声功率540W、超声时间18min、提取温度60℃、液料比8.6:1(mL/g)，在此工艺条件下，仿栗籽油提取率为94.53%，与理论预测值仅相差0.95%，说明运用响应面法优化得到的模型工艺参数准确可靠，应用价值较高。

2.3 仿栗籽油的气相色谱-质谱联用分析结果

对上述试验所得仿栗籽油经甲酯化处理后进行气相色谱-质谱联用分析，测定脂肪酸组成，利用NIST 05标准谱库进行检索，并逐个解析各峰相应的质谱图，采用不做校正的峰面积归一法确定各组分的相对含量。仿栗籽油的脂肪酸甲酯气相色谱-质谱联用分析总离子流色谱图见图8，分析结果见表4。

图8 仿栗籽油脂肪酸甲酯总离子流色谱图Fig.8 Total ion current chromatogram of fatty acids in Sloanea hemsleyana seed oil

表4 仿栗籽油脂肪酸的组成及相对含量Table 4 Fatty acids and relative contents in Sloanea hemsleyana seed oil

由表4可知，仿栗籽油中主要含有肉豆寇酸、棕榈酸、亚油酸、油酸、硬脂酸5种脂肪酸，不饱和脂肪酸相对含量达70.13%，其中油酸和亚油酸相对含量分别为53.95%和16.18%。

3 结 论

采用响应面分析法优化了超声波辅助提取仿栗籽油工艺条件，建立了相应的数学模型，模型回归极显著，对试验拟合较好；得到了优化提取工艺条件：以环己烷为提取溶剂、超声工作/间歇时间3s/1s、超声功率540W、超声时间18min、提取温度60℃、液料比8.6:1(mL/g)，在此工艺条件下，仿栗籽油提取率可达94.53%，与数学模型的理论预测值基本一致。并对仿栗籽油的脂肪酸组成进行气质联用分析，结果表明仿栗籽油中主要含有肉豆寇酸、棕榈酸、亚油酸、油酸、硬脂酸5种脂肪酸，其中不饱和脂肪酸含量为70.13%，以油酸、亚油酸为主，具有较高的开发利用价值。

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Response Surface Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction and Fatty Acid Composition Analysis ofSloanea hemsleyanaSeed Oil

MA Cheng-jin1,2，HUANG Wei2，HUANG Qun2，WU Zhu-qing2，WU Li-ya2
(1. Key Laboratory of Hunan Forest Products and Chemical Industry Engineering, Jishou University, Zhangjiajie 427000, China；2. Institute of Food Science, Jishou University, Jishou 416000, China)

Response surface methodology (RSM) was employed to optimize the ultrasound-assisted extraction of essential oil fromSloanea hemsleyanaseeds. Meanwhile, the chemical composition of the extracted essential oil was analyzed by GC-MS.The results showed that the optimal extraction conditions were cyclohexane as the best extraction solvent, single ultrasonic treatment for 3 s at a power level of 540 W followed by a 1-s interval, 18 min of total extraction time, and 1:8.6 of solid-to-liquid ratio, resulting in an oil yield of 94.53%. The essential oil obtained under these conditions was abundant in unsaturated fatty acids with a total content of 70.13%. The contents of oleic acid and linoleic acid were 53.95% and 16.18%, respectively.

Sloanea hemsleyanaseed oil；ultrasonic-assisted extraction；response surface analysis；GC-MS；fatty acid composition

TS224.4

A

1002-6630(2012)16-0024-06

2012-04-10

湖南省高校创新平台开放基金项目(09K089)；林产化工工程湖南省重点实验室开放项目(JDZ201101)

麻成金(1963—)，男，教授，硕士，研究方向为食物资源开发与利用。E-mail：machengjin368@126.com