响应面法优化玉米须黄酮提取工艺

张 艳，李海涛，周鸿立,*

(1.吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022；2.长春中医药大学附属医院药剂科，吉林 长春 130021)

响应面法优化玉米须黄酮提取工艺

张 艳1，李海涛2，周鸿立1,*

(1.吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022；2.长春中医药大学附属医院药剂科，吉林 长春 130021)

采用响应面法优化玉米须黄酮的提取工艺条件。以乙醇体积分数、提取温度、提取时间和料液比为考察因素，黄酮提取率为响应值，进行四因素三水平Box-Behnken试验设计，获得多元二次回归方程；考察玉米须黄酮体内抗氧化作用。结果表明：最佳提取工艺条件为乙醇体积分数58%、提取温度78℃、提取时间1.7h、料液比1:26(g/mL)，此工艺条件黄酮得率为0.41%。玉米须黄酮能够降低血清和肝脏中的丙二醛含量，增加超氧化物歧化酶活力，具有一定的抗氧化能力。

玉米须黄酮；响应面；抗氧化

玉米(Zea maysL.)为禾本科玉蜀属植物，是我国广泛种植的传统农作物。玉米须为玉米的花柱和柱头，是我国传统药食同源的中草药，为《中华人民共和国卫生部药材标准》收录的常用药材品种之一。玉米须具有利水消肿、降压降糖等功效，用于治疗水肿、黄疸、高血压、糖尿病等病症；含有多种活性成分[1-3]，如黄酮类、多糖类、挥发油、皂苷等。

响应面分析法[4-8]是利用合理的试验设计，通过试验得到的相关数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。随着计算机的发展，它已广泛地应用于农业、生物、食品、化学、制造等领域。目前关于玉米须黄酮提取工艺的报道[9-13]，多采用正交试验设计的方法，而采用响应面法优化玉米须黄酮提取工艺尚未见报道。本研究以玉米须为试验材料，利用Box-Behnken试验设计原理，采用四因素三水平的响应面分析法，优化玉米须黄酮提取的最佳工艺条件，并研究其体内抗氧化作用，为进一步开发和利用玉米须资源提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米须2010年10月采收于吉林省吉林市郊区，经吉林大学王广树教授鉴定为玉蜀黍玉米(Zea maysL.)的干燥花柱和柱头，实验前洗净、晒干、剪碎、干燥通风处保存。

无水乙醇、三氯化铝、甲醇均为国产分析纯；丙二醛、超氧化物化酶、考马斯亮蓝试剂盒 南京建成试剂有限公司；芦丁对照品 中国(长春)药品生物制品检定所。

1.2 仪器与设备

RE-52A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；HH-S恒温水浴锅 江苏省金坛市正基仪器有限公司；725型紫外光栅分光光度计 山东高密彩虹分析仪器有限公司；LDZ-5-2低速自动平衡离心机 北京医用离心机厂；FA-2004分析天平 上海精细科技仪器厂。

1.3 试验动物

ICR小鼠，18～22g，合格证号：医动字第scxk-(吉)-2010-0011，由长春高新医学动物研究中心提供。

1.4 方法

1.4.1 标准曲线的制备

精密吸取芦丁对照品溶液(0.1mg/mL)0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于6只25mL容量瓶中，加体积分数60%乙醇溶液至5mL，然后分别加入0.1mol/mL三氯化铝-甲醇溶液10mL，用体积分数60%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，放置10min，在272nm波长处测定吸光度。以吸光度为横坐标、对照品质量浓度为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程为：Y＝29.302x＋0.0213，R2＝0.9999，在0.1～0.5mg/mL之间有良好的线性关系。

1.4.2 单因素试验

考察乙醇体积分数、温度、提取时间、料液比4个因素对玉米须黄酮提取率的影响，用热回流法进行提取，按标准曲线方法计算黄酮含量，选择最佳单因素提取条件。每次准确称取玉米须2.0g，分别以乙醇体积分数(40%、50%、60%、70%、80%)、提取温度(50、60、70、80、90℃)、提取时间(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h)和料液比(g/mL)(1:15、1:20、1:25、1:30、1:35)为影响因素进行试验。单因素试验的固定工艺条件为乙醇体积分数60%、提取温度80℃、提取2.0h、料液比1:30。

1.4.3 响应面试验设计

根据Box-Behnken试验设计原理，在单因素试验基础上，确定响应面设计中每个因素的适宜范围。以乙醇体积分数(X1)、提取温度(X2)、提取时间(X3)、料液比(X4)为考察对象，以黄酮提取率为参考值(Y)，采用SAS 9.1软件进行响应面试验设计，试验因素水平见表1。

表1 玉米须黄酮提取工艺优化Box-Behnken试验因素与水平Table 1 Factors and their coded levels tested in response surface analysis

1.4.4 玉米须黄酮粗提物抗氧化实验

按照最佳工艺条件提取所得到的玉米须黄酮粗提物，经真空干燥后，以水为溶剂分别配成1 0、2 0、40mg/mL溶液。将ICR小鼠随机分为空白组、阳性药组以及玉米须黄酮粗提物低、中、高剂量组，每组10只。空白组给予水，阳性药组按照400mg/kg给予VC，低、中、高剂量组分别按照200、400、800mg/kg给予玉米须黄酮粗提物，连续灌胃给药30d。末次给药前禁食不禁水12h，末次给药1h后，摘眼球取血，分离血清，取肝脏，以试剂盒方法测定血清及肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)的含量，采用SPSS软件对数据进行t检验。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

图1 各单因素对提取率的影响Fig.1 One-factor-at-a-time analysis of the effects of ethanol concentration, extraction temperature, extraction time, material-to-liquid ratio on extraction rate of flavonoids

由图1可知，乙醇体积分数为60%时，黄酮的提取率最大，此后随乙醇体积分数的增大提取率减少，可能由于60%乙醇溶液的极性与黄酮类化合物极性相似，随着乙醇体积分数的升高，一些脂溶性物质的溶出增加，影响了黄酮类物质的浸出；提取温度为80℃时，提取率最大，超过80℃，提取率下降,可能由于温度升高，提取溶剂挥发，导致提取率下降；提取时间为2.0h时，提取率最大，超过2.0h，提取率下降，可能是由于原因是时间过短，黄酮类物质还未充分溶出，时间过长，一些热敏性组分被破坏或溶剂挥发导致乙醇浓度降低而使黄酮类化合物提取率降低；料液比为1:30(g/mL)时，提取率最大，此后提取率降低。

2.2 响应面法试验设计结果及方差分析

表2 玉米须黄酮提取工艺优化响应面试验设计及结果

Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

试验号 X1 X2 X3 X4 Y提取率/%1 －1 －1 0 0 0.2698 2 －1 1 0 0 0.3591 3 1 －1 0 0 0.2365 4 1 1 0 0 0.3413 5 0 －1 －1 0.2550 6 0 0 －1 1 0.2586 0 7 1 －1 0.2846 8 0 0 1 1 0.3556 0 0 9 －1 0 0 －1 0.2846 10 －1 0 0 1 0.3301 11 1 0 0 －1 0.2537 12 1 0 0 1 0.3080 13 0 －1 －1 0 0.2383 14 0 －1 1 0 0.2396 15 0 1 －1 0 0.3138 16 0 1 1 0 0.3955 17 －1 0 －1 0 0.2791 18 －1 0 1 0 0.3507 19 1 0 －1 0 0.2329 20 1 0 1 0 0.2725 21 0 －1 0 －1 0.2262 22 0 －1 0 1 0.2419 23 0 1 0 －1 0.3686 24 0 1 0 1 0.3899 25 0 0 0 0 0.3528 26 0 0 0 0 0.3624 27 0 0 0 0 0.3525

通过SAS 9.1软件对表2试验结果分析获得多元二次回归方程：

表3 玉米须黄酮提取工艺优化数学模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

图2 各两因素交互作用对玉米须黄酮提取率影响的响应面及等高线图Fig.2 Response surface and contour plots showing the effects of four process parameters on extraction rate of flavonoids

由图2c可知，黄酮提取率随提取时间的延长和温度提高呈先上升后下降的趋势，且二者有明显的交互作用。可能由于延长提取时间有助于黄酮的充分扩散析出，同时温度的升高使得分子扩散运动速度加快，黄酮的析出速率和提取率提高。由图2f可知，提取时间较长、乙醇体积分数较高条件下黄酮提取率较高，二者有明显的交互作用。可能由于乙醇体积分数较低时黄酮溶解度较差，提取时间的延长使大量水溶性杂质如多糖溶出，提取液变得黏稠对黄酮产生吸附作用，不利于黄酮的快速扩散溶出。

2.3 反应条件的优化与模型验证

由SAS 9.1软件岭脊分析得到Y值最大时，X1、X2、X3、X4对应的编码值分别为X1＝－0.17569、X2＝0.84631、X3＝0.42665，X4＝0.26619。对应的最佳工艺条件为乙醇体积分数58.2431%、提取温度78.4631℃、提取时间1.7133h、料液比1:26.3306(g/mL)，黄酮提取率理论值为0.4104%。

选取乙醇体积分数58%、提取温度78℃、提取时间1.7h、料液比1:26(g/mL)进行验证实验，3次平行试验得到实际平均提取率为0.41%，较理论值高0.005%。因此，采用响应面设计优化得到的玉米须黄酮提取条件参数准确可靠，对实际应用有一定的价值。

2.4 抗氧化实验

表4 玉米须黄酮粗提物对小鼠MDA含量和SOD活力的影响(n=10)Table 4 Effect of corn silk flavonoids on MDA content and SOD activity in mice (n=10)

由表4可知，与空白组比较，低剂量组血清MDA含量明显降低，P＜0.05；中、高剂量组血清和肝脏组织中MDA含量明显降低，P＜0.05；高剂量组血清和肝脏组织SOD活力明显升高。MDA作为脂质过氧化的最终产物是衡量机体自由基代谢的敏感指标，其含量能客观地反映机体产生自由基的水平[18-20]。从结果可知，玉米须黄酮有较好的清除自由的能力，并能增加清除自由基的酶SOD的活力。

3 结 论

利用软件SAS 9.1软件进行试验设计，采用响应曲面法建立玉米须黄酮提取工艺条件的二次多项式数学模型，分析了各因素对响应值的影响。结果表明，模型拟合程度高，试验误差小，最佳的提取工艺条件为乙醇体积分数58%、提取温度78℃、提取时间1.7h、料液比1:26(g/mL)，此工艺条件的黄酮提取率为0.41%。研究表明，从玉米须分离及鉴定的化合物主要有黄酮及其苷类、甾醇、生物碱、糖类、有机酸、挥发油、皂苷、微量元素及多种维生素等。本实验采用乙醇为提取溶剂，主要提取对象为黄酮苷类。体内抗氧化试验表明，玉米须黄酮粗提物有一定的抗氧化能力，能够降低血清和肝脏中的MDA含量，增加SOD活力，因此，抗氧化实验可为开发玉米须黄酮作为潜在天然抗氧化剂应用于食品和医药工业中提供理论依据。

[1]徐燕, 梁敬钰. 玉米须的化学成分研究[J]. 中草药, 2006, 37(6): 831-833.

[2]任顺成, 丁霄霖. 玉米须黄酮类成分的提取分离与结构鉴定(Ⅰ)[J]. 中草药, 2004, 35(8): 857-858.

[3]徐燕, 邹中梅, 梁敬钰. 玉米须的化学成分[J]. 中国天然药物, 2008,6(3): 237-238.

[4]沈其君. SAS统计分析[M]. 南京: 东南大学出版社, 2009: 9-56.

[5]慕运动. 响应面方法及其在食品工业中的应用[J]. 郑州工程学院学报, 2001, 22(3): 91-94.

[6]AHUJA S K, FERREIRA G M, MOREIRA A R. Application of Plaekett-Burman design and response surface methodology to achieve exponential growth for aggregated shipworm bacterium[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2004, 85(6): 666-675.

[7]SILVA E M, ROGEZ H, LARONDELLE Y. Optimization of extraction of phenolics fromInga edulisleaves using response surface methodology[J]. Separation and Purification Technology, 2007, 55(3): 381-387.

[8]WANG Jing, SUN Baoguo, CAO Yanping, et al. Optimisation of ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds from wheat bran[J].Food Chemistry, 2008, 106(2): 804-810.

[9]胡改鑫, 杨尧, 杨思思, 等. 超声波提取玉米须总黄酮的工艺研究[J].粮油加工, 2009, 12(3): 120-122.

[10]ZHOU hongli, DONG Weiquan, XIAO Zhenjing, et al. Microwaveassisted extraction of total flavonoids from corn silk[J]. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research, 2011, 22(2): 483-485.

[11]王宁, 徐艳, 韩笑非. 酶法提取玉米须总黄酮工艺研究试验[J]. 辽宁中医杂志, 2009, 36(6): 994-996.

[12]任顺成, 丁霄霖. 玉米须中总黄酮的提取及树脂精制[J]. 中草药,2003, 34(12): 1092-1094.

[13]JOSEPH N N. Inhibition ofAspergillus flavusgrowth by silk extracts of resistant and susceptible corn[J]. J Agr Food Chem, 1996, 44(8): 1982-1983.

[14]纪丽莲, 范怡梅. 玉米须提取物对食品腐败菌及致病菌抑制作用的研究[J]. 食品科学, 2000, 21(12): 131-134.

[15]LIU Wei, YU Yanying, YANG Ruzhen, et al. Optimization of total flavonoid compound extraction from gynura medica leaf using response surface methodology and chemical composition analysis[J]. Int J Mol Sci, 2010, 11(11): 4750-4763.

[16]XIAO Weihua, HAN Lujia, SHI Bo. Optimization of microwave-assisted extraction of flavonoid fromRadix Astragaliusing response surface methodology[J]. Sep Sci and Technol, 2008, 43(3): 671-681.

[17]ASHAN S E, MIGANAD T, ARIFF A, et al. Optimization of enzymatic synthesis of palm-based kojic acid ester using response surface methodology[J]. J Oleo Sci, 2009, 58(10): 503-510.

[18]方敏, 占才贵, 宫智勇. 玉米须总黄酮的提取与抗氧化活性研究[J].食品科学, 2009, 30(18): 206-208.

[19]MILLER S S, REID L M, BUTLER G, et al. Long chain alkanes in silk extracts of maize genotypes with varying resistance toFusarium graminearum[J]. J Agri Food Chem, 2003, 51(23): 6702-6708.

[20]熊皓平, 杨伟丽, 张友胜, 等. 天然植物抗氧化剂的研究进展[J]. 天然产物研究与开发, 2001, 15(5): 75-78.

Optimization of Extraction Process for Flavonoids from Corn Silk by Response Surface Methodology

ZHANG Yan1，LI Hai-tao2，ZHOU Hong-li1,*
(1. School of Chemical and Pharmaceutical Engineering, Jilin Institute of Chemical Technology, Jilin 132022, China；2. Department of Pharmacy, Changchun University of Traditional Chinese Medicine Hospital, Changchun 130021, China)

This work reports the use of response surface methodology optimize the extraction of flavonoids from corn silk.The extraction yield of flavonoids was investigated with respect to four variables including ethanol concentration, temperature,time and material-to-liquid ratio. A multivariable quadratic regression equation was built using a four-variable, three-level Box-Behnken experimental design. The optimal conditions for extracting flavonoids from corn silk were determined as 1.7 h extraction with 58% ethanol at a material-to-liquid ratio of 1:26 (g/mL) and 78 ℃. Under these conditions, the extraction efficiency of flavonoids was 0.41%. Oral ingestion of the flavonoids extracted from corn silk resulted in reduced MDA content in the serum and liver of mice and enhanced SOD activity, suggesting that these compounds have antioxidant effects in mice.

flavonoids from corn silk；response surface methodology；antioxidation

R285.5

A

1002-6630(2012)18-0133-05

2011-08-15

吉林省教育厅科技项目(2010第175号)

张艳(1981—)，女，讲师，博士，研究方向为中药药理学。E-mail：zyzxorange@126.com

*通信作者：周鸿立(1967—)，女，教授，博士，研究方向为中药化学。E-mail：zhl67@126.com