黔江肾豆蛋白质提取工艺优化及其功能性质研究

熊家艳，邓利玲，范超敏，邹泊羽，钟 耕,2,*

(1.西南大学食品科学学院，重庆 400716；2.重庆市特色食品研究工程技术中心，重庆 400716)

黔江肾豆蛋白质提取工艺优化及其功能性质研究

熊家艳1，邓利玲1，范超敏1，邹泊羽1，钟 耕1,2,*

(1.西南大学食品科学学院，重庆 400716；2.重庆市特色食品研究工程技术中心，重庆 400716)

以黔江肾豆为原料，采用单因素法研究pH值、温度、液料比、提取时间等因素对其蛋白质提取率的影响，在此基础上通过响应面分析法优化得出最佳工艺条件碱提pH8.93、液料比10.67:1(mL/g)、提取时间22min、提取温度48℃，并对提取所得分离蛋白的持水力、吸油性、起泡性、乳化性等功能性质进行测定分析。

黔江肾豆；蛋白提取；分离蛋白；功能性质

芸豆，学名菜豆(kidney bean)，为豆科(Leguminosae)，蝶形花亚科(Papilionoideae)，菜豆族(Phaseoleae)，菜豆属(Ph a s e o lu s)植物，主要栽培种包括多花菜豆(Phaseolus multiflorusWilld)和普通菜豆(Phaseolus vulgarislL.)[1]。本实验研究材料黔江肾豆属普通菜豆。

芸豆是全球性的出口农产品，中国是世界芸豆生产、出口大国，种植面积仅次于印度和巴西，总产量超过82万吨，产量高品质优良，平均单产超过世界平均单产两倍以上[2]。近年出口量在30万吨到63万吨左右，为我国最主要出口杂豆类，相较大宗粮食作物，出口的价格具有明显优势，在农产品出口中具有明显的竞争优势[3]。

作为重庆黔江地区特色经济作物，肾豆具有主根发达、根瘤有固氮能力，喜温耐寒、对光照要求不严格等生物学特性，对于云贵川渝等地大面积冷凉山区其他作物低产甚至无产的贫瘠山坡地极具栽培种植优势。黔江肾豆感官性质优良、对其营养价值民众认同基础较高，具有较大的潜在开发利用价值。黔江肾豆蛋白质含量较高，经测定达(23.08±0.97)%，水分含量(12.21±0.05)%，氨基酸组成评价分析表明，是优良植物蛋白资源。

本实验研究pH值、温度、液料比、提取时间等因素对蛋白质提取率的影响，在此基础上采用响应面方法优化肾豆蛋白质的提取条件，测定分析分离蛋白持水力、吸油性、起泡性、乳化性等功能性质，为肾豆蛋白的提取、开发和利用提供理论基础和应用依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黔江肾豆(E108°28′04″～108°56′56″， N29°04′29″～29°52′10″)产于重庆黔江；大豆油 金龙鱼公司；酪蛋白(化学纯，经自动凯氏定氮测定蛋白含量为(74.09 ±0.33)%) 成都科龙化工试剂厂；Folin-酚试剂乙(分析纯) Solabio公司。

Folin-酚试剂甲：A液50mL和B液1mL混合配制，现用现配；FoLin-酚试剂A液：1g碳酸钠溶于50mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液中；Folin-酚试剂B液：将1%硫酸溶液和20g/L酒石酸钠溶液等体积混合配成；蛋白标准溶液：准确称取已测定蛋白质质量浓度(凯氏定氮法)的酪蛋白配制成150μg/mL蛋白标准溶液。其他试剂未经注明，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DHG-9070A鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司；BM251粉碎机 美的集团公司；JH722可见光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；PHS-3C型pH计 上海盛磁仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司；KjelFlex K-360自动凯氏定氮仪 瑞士Buchi公司；金燕FSH-2型可调高速匀浆机 江苏大地自动化仪器厂&环保仪器厂；4K15离心机 美国Sigma公司；ALPAAI-4LSC真空冷冻干燥机 美国Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 原材料准备

肾豆籽粒手工去除杂质及不完善粒，纯水浸泡，手工脱皮，60℃干燥后粉碎，过80目筛，筛上部分重新粉碎，过筛。介于肾豆本身脂肪含量很低，避免脱脂过程加工处理及接触试剂对蛋白的不利影响，不进行脱脂处理。处理好的豆粉密封置4℃保存备用[4]。

1.3.2 肾豆蛋白等电点确定

参照文献[5]方法略做改进，平行测定3次。

1.3.3 肾豆蛋白提取工艺

1.3.3.1 提取工艺[6]

称取约5g豆粉，以所需比例去离子水分散，调节pH值至预定值，水浴加热到预定温度，水浴振荡提取一定时间，5000r/min离心10min，上清液定容后取一定量用Folin-酚法测定其蛋白质含量。计算提取率：

1.3.3.2 提取试验优化设计

研究碱提pH值、料液比、提取时间、提取温度等因素对肾豆蛋白提取率的影响，在此单因素试验结果基础上采用响应面方法优化提取条件，以碱提pH值、料液比、提取时间、提取温度为自变量，提取率为响应值通过Design Expert 7.0软件进行4因素3水平响应面试验设计和数据回归分析，确定肾豆蛋白提取的最优工艺参数，取3次平行实验的平均值。

1.3.4 肾豆蛋白基本成分及功能性质测定

1.3.4.1 肾豆蛋白基本成分[7]

粗蛋白含量：自动凯氏定氮仪凯氏定氮法测定；水分：105℃直接干燥法测定；灰分：高温灼烧称量法；粗脂肪：索氏抽提法。

1.3.4.2 肾豆蛋白功能性质

肾豆分离蛋白持水性、吸油性的测定：参照Kaur等[8]方法；起泡性和起泡稳定性：参照郭兴凤等[9]方法；乳化性和乳化稳定性：参照Pearce等[10]方法并做相应改动。

1.3.5 数据处理

使用Design Expert 7.0、SPSS 15.0软件进行实验设计和结果统计分析。

2 结果与分析

2.1 建立FoLin-酚标准曲线

通过酪蛋白标准液Folin-酚反应建立吸光度(A)与蛋白质质量浓度标准曲线，回归方程：

蛋白质质量浓度/(μg/mL)＝827.403A－58.780，R2≥0.999，P＜0.01。

2.2 肾豆蛋白等电点确定

蛋白质分子在等电点易发生聚集而沉降，使溶解度降低，通过测定不同沉降pH值处理的蛋白溶液氮溶指数(nitrogen solubility index，NSI)，可测得蛋白质等电点。见图1，该蛋白质在pH4.50时的氮溶指数比陡然降低，表明pH4.50时该蛋白质溶解度最小，即为其等电点。分离肾豆蛋白质时应用酸沉pH值。

图1 不同pH值时氮溶指数Fig.1 Nitrogen solubility index (NSI) obtained for kidney bean protein under various pH conditions

2.3 各因素对蛋白质提取率的影响

2.3.1 碱提pH值对提取率的影响

固定液料比10:1、提取温度60℃、提取时间90min。由图2可知，碱提pH值对蛋白提取率影响较大，当pH9.00时达到最大，随后降低。

图2 pH值对提取率的影响Fig.2 Effect of pH on the extraction rate of ASP

2.3.2 液料比对提取率的影响

固定碱提pH9.0、提取温度60℃、提取时间90min。由图3可知，液料比在10:1以下时，蛋白提取率随加液量的增加而逐渐升高，当液料比大于10以后，继续增加提取液比例对蛋白提取率的提高作用不明显。

图3 液料比对提取率的影响Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on the extraction rate of ASP

2.3.3 提取时间比对提取率的影响

固定碱提pH9.0、液料比10:1、提取温度60℃。由图4可知，随时间增长，提取率增加，20min时达到最高，但时间继续增长提取率则下降。

图4 提取时间对提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on the extraction rate of ASP

2.3.4 温度对提取率的影响

固定碱提pH9.0、液料比10:1、提取时间90min。由图5可知，提取温度为50℃时，提取率最高。

图5 提取温度对提取率的影响Fig.5 Effect of extraction temperature on the extraction rate of ASP

2.4 响应面分析试验设计[11]与结果分析

表1 黔江肾豆蛋白质提取工艺优化响应面分析试验因素与水平Table 1 Coded values and corresponding real values of the optimization parameters used in response surface analysis

表2 黔江肾豆蛋白质提取工艺优化响应面分析试验设计及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

碱提pH值、料液比、提取时间、提取温度对提取率影响均极显著(P＜0.01)，以提取率为响应值，通过Design Expert 7.0设计4因素3水平响应面分析试验。试验因素及水平见表1，试验设计及结果见表2。

通过Design Expert 7.0软件对响应值与各因素进行回归拟合，得到回归方程：

提取率Y＝17.88－0.17A＋0.27B－0.24C－0.23D－0.27AB－0.027AC＋0.037AD－0.013BC＋0.022BD－0.018CD－1.05A2－0.45B2－0.65C2－0.63D2

表3 回归分析结果Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic regression model

如表3所示，该回归模型相对于真实值，R2＝0.9579，拟合度高，回归极显著。模型失拟值相对于纯误差显著性评价为不显著，F＝0.75，P＝0.6786＞0.1，表明所建模型成立。各自变量二次项及自变量B、C、D影响极显著，自变量碱提pH值、碱提pH值及液料比间交互作用对响应值影响显著。各因素对提取率影响程度为各变量二次项＞液料比＞提取时间＞提取温度＞碱提pH值＞碱提pH值及液料比的交互影响作用。

响应面分析结果见图6，曲面图直观反映模型设定反应条件同提取率间对应关系，等高图能直观看出各因素交互作用对提取率的影响。椭圆表示二因素交互作用显著，等高线越趋向于圆表示其交互作用越不显著[12]。由图6可见，在本研究取值范围内，碱提pH与液料比交互作用较显著。

通过Design Expert 得出最优化提取工艺条件为碱提pH8.93、液料比10.67:1(mL/g)、提取时间21.88min、提取温度48.20℃，回归模型预测提取率理论值达(17.98± 0.08)%。考虑到实际实验条件，确定修正提取工艺条件为碱提pH8.93、液料比10.67:1(mL/g)、提取时间22min、提取温度48℃。验证实验提取率实测值18.02%，实测值与回归方程预测值吻合良好。

图6 各两因素交互作用对蛋白提取率影响的响应面及等高线图Fig.6 Response surface and contour plots for the effects of four variables on the extraction rate of ASP

2.5 肾豆分离蛋白基本成分及功能性质测定结果

2.5.1 肾豆分离肾白基本成分

表4 肾豆分离肾白基本成分Table 4 Proximate chemical composition of ASP extracted from kidney beans

由表4可知，肾豆分离蛋白质的蛋白含量(82.41± 0.89)%，参照大豆蛋白粉国家标准，除水分含量稍偏高外，其余均在限值内。肾豆分离蛋白粉呈淡黄色、无异味。

2.5.2 持水性

蛋白质的持水性影响食品体系整体水分含量、水分保持情况，添加在食品体系中通常应用其增稠、保湿等功能性质。体系pH值及温度对分离蛋白持水性的影响见图7，pH值和温度对持水性影响明显，当pH5时，持水性最低，因为接近蛋白质等电点，蛋白质分子的分散程度较低，水化能力小。随着pH值远离等电点，蛋白质所带净电荷增多，蛋白质分子的静电斥力增加、分散程度增高，水化能力和持水性增强，pH9.0时最高，之后随pH值继续增高，持水性反而下降，推测是过高pH值导致蛋白质变性所致。在60℃以下时，持水性随温度的升高而增大，这可能是由于温度增加使蛋白质溶解度增大，并且在温度和水分共同作用下致密的结构构象发生了一定的改变，蛋白质分子的解离伸展有利于蛋白质分子和水分子的相互作用；但随着温度的进一步升高，蛋白质变性致使蛋白质持水性下降。

图7 pH值及温度对肾豆分离蛋白持水性的影响Fig.7 Effects of pH and temperature on water-holding capacity of ASP extracted from kidney beans

2.5.3 吸油性

肾豆分离蛋白在不同温度下吸附油脂能力见图8，从室温20℃开始，分离蛋白的吸油性随温度的升高而升高，可能原因是随温度升高，蛋白质分子发生伸展、解离、变性等构象变化，内部非极性键曝露且油脂结合能力增大。但在0℃时，表现为较高吸油性，可能是因为低温使油的流动性降低，更容易被蛋白分子截留。

图8 温度对肾豆分离蛋白持油性的影响Fig.8 Effect of temperature on oil-absorbing capacity of isolated protein of ASP extracted from kidney beans

2.5.4 起泡及起泡稳定性

起泡性及起泡稳定性反映蛋白质搅打起泡的能力，蛋白质在气-液界面形成坚韧的薄膜，使大量气泡进入和稳定的能力，与蛋白质的种类、pH值、温度、蛋白质质量分数等有着密切关系。

起泡度越大，表明体系起泡性能越强，失水率越低表示泡沫体系越稳定。肾豆分离蛋白起泡性及起泡稳定性受pH值、温度及蛋白浓度影响见图9，pH值对肾豆蛋白起泡能力影响较大，pH5.0时最低，pH9.0时最高，估计原因是pH值对于蛋白电荷及结构的影响，远离等电点的pH值造成蛋白与水作用力强，起泡力和稳定性较高，但过高的pH值造成蛋白表面结构的变化使得起泡力减弱且失水率增高[13]。随着温度升高，蛋白起泡力逐渐增强，加热有助于蛋白质伸展，利于形成泡沫，但是随着温度的升高，水分挥发加快、气体膨胀、气泡易破裂、泡沫易解体，所以体系泡沫稳定性变化较平缓泡沫体系稳定性降低。

起泡力、泡沫稳定性与分离蛋白质量分数正相关，质量分数越大起泡力越大泡沫体系越稳定、但5%质量分数以上，曲线变化趋势较缓。

图9 pH值、温度、质量分数对肾豆分离蛋白起泡力及失水率的影响Fig.9 Effects of pH, temperature and protein concentration on foaming capacity and water loss rate of ASP extracted from kidney beans

2.5.5 乳化性(emulsifying activity index，EAI)及乳化稳定性(emulsification stability index，ESI)

pH值、温度、质量分数对肾豆分离蛋白乳化能力的影响见图10。蛋白质是两性物质，随着pH值的变化，蛋白分子表面的带电情况及溶解度随之变化，致使其乳化能力及乳化稳定性发生变化。在pH5.0时接近等电点，表现出乳化性最弱但乳化稳定性最高的特殊性，可能是由于在蛋白质的等电点蛋白质分子表面电荷为0，能吸附在油水界面的蛋白质少，但由于蛋白质间静电排斥作用小促使蛋白质进一步在油水界面重排堆积，促进了高强度膜的形成，阻止油滴聚集上浮从而提高了乳状液的稳定性[14]。之后随pH值升高，远离等电点，EAI升高，ESI值基本持平。

提高温度有助于蛋白分子在溶液中构型展开，蛋白质分子吸收能量使内能增加，导致空间构型中部分化学键键断裂，包含在球状分子内疏水性基团外露，因而乳化能力增强，在20～60℃间，温度升高对乳化性作用效果显著，乳化性有较明显提高，而60℃后，变化趋于平缓。乳化稳定性也随温度升高而增强。

EAI值随分离蛋白质量分数升高而升高，在质量分数1%～5%范围内影响显著，当质量分数继续升高至10%，增长趋缓，但ESI值持续升高。

图10 pH值、温度、质量分数对肾豆分离蛋白乳化能力的影响Fig.10 Effects of pH, temperature and protein concentration on emulsifying properties of ASP extracted from kidney beans

3 结 论

3.1 确定肾豆蛋白等电点为4.50，与多数植物蛋白质相似。

3.2 通过响应面分析法优化得出最佳工艺条件碱提pH8.93、液料比10.67:1(mL/g)、提取时间21.88min、提取温度48.20℃，回归模型预测提取率理论值达(17.98± 0.08)%。工艺条件经修订为pH8.93、液料比10.67:1(mL/g)、提取时间22min、提取温度48℃。在此条件下肾豆蛋白实际提取率为18.02%，实测值与回归方程预测值吻合良好。

3.3 肾豆分离蛋白粉淡黄色、无异味，蛋白含量(82.41± 0.89)%，参照大豆蛋白粉国家标准，除水分含量稍偏高外，其余均在限值内。

3.4 肾豆分离蛋白持水性最低值在pH5.0，最高值在pH9.0，随温度升高而先升高后降低，60℃时为最大值。20℃时吸油性最差，之后随温度升高而增强。起泡及泡沫稳定性、乳化及乳化稳定性在pH5.0处表现特殊，起泡、乳化能力最低但泡沫稳定性、乳化稳定性最高。之后随pH值升高起泡能力升高但泡沫稳定性有所降低，乳化能力及乳化稳定性升高。

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Optimization of Extraction Process and Functional Properties of Protein from Kidney Beans Grown in Qianjiang Region

XIONG Jia-yan1，DENG Li-ling1，FAN Chao-min1，ZOU Bo-yu1，ZHONG Geng1,2,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China；2. Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, Chongqing 400716, China)

In this study, the effects of pH, temperature, material-to-liquid ratio, and extraction time on the extraction rate of alkali-soluble protein (ASP) from kidney beans grown in Qiangjiang region were explored by one-factor-at-a-time design. The optimal process conditions for ASP extraction were determined by response surface methodology as pH 8.93, material-to-liquid ratio of 1:10.67, extraction time of 22 min, and extraction temperature of 48 ℃. The protein isolate obtained under these conditions was analyzed for functional properties such as water-holding capacity, oil-absorbing capacity, foaming properties and emulsifying properties.

kidney beans grown in Qiangjiang region；protein extraction；protein isolate；functional properties

TS201.1

A

1002-6630(2012)18-0025-07

2011-07-26

重庆高校优秀成果转化项目(KJZH08221)

熊家艳(1991—)，女，硕士研究生，主要从事现代食品加工理论与技术研究。E-mail：xiongjiayan@163.com

*通信作者：钟耕(1964—)，男，教授，博士后，主要从事粮食工程及现代食品加工理论与技术研究。E-mail：zhongdg@126.com