15种植物不同溶剂萃取物乙酰胆碱酯酶抑制活性的初步研究

殷帅文，刘丽萍，王安萍，毛恺俊，熊 欣

15种植物不同溶剂萃取物乙酰胆碱酯酶抑制活性的初步研究

*殷帅文1,2，刘丽萍1，王安萍1,2，毛恺俊1，熊 欣1

（1.井冈山大学生命科学学院，江西，吉安343009；2.江西省生物多样性与生态工程重点实验室，江西，吉安343009）

采用乙酰胆碱酯酶抑制活性筛选模型，对采自井冈山及周边地区的15种植物（22个部位）乙醇提取物的不同溶剂萃取物进行乙酰胆碱酯酶抑制活性研究。结果表明：在乙酸乙酯萃取物中，供试质量浓度在1 mg/mL时，大部分植物均表现出一定的乙酰胆碱酯酶抑制活性，其中铁扫帚、龙爪槐茎、金银花和女贞叶表现出较强的抑制活性，抑制率均大于70%，其余大部分植物的抑制率均小于40%。在供试质量浓度在0.025 mg/mL时，只有接骨木和南方荚蒾的抑制率大于60%，其余大部分植物的抑制活性均小于 30%；在正丁醇萃取物中，供试质量浓度在 1 mg/mL时，15种植物均具有明显的乙酰胆碱酯酶抑制活性，其中铁扫帚、龙爪槐叶、龙爪槐茎和金银花茎的抑制率均大于85%，其余大部分植物的抑制率均大于40%。供试质量浓度在0.025 mg/mL时，夹竹桃的抑制率大于80%。其余大部分植物的抑制率均小于40%；在石油醚萃取物中，供试质量浓度在 1 mg/mL时，15种植物均具有明显的乙酰胆碱酯酶抑制活性，其中菜豆、爬山虎叶、南方荚蒾和女贞叶的抑制率均大于90%。供试质量浓度在 0.025 mg/mL时，仍有部分植物表现出较高的乙酰胆碱酯酶抑制活性，其中抑制率大于80%的分别有爬山虎叶、鸡眼草、金银花茎、迎春花茎和叶。另外，有些植物萃取物不仅对乙酰胆碱酯酶没有抑制活性，反而表现出一定的增强作用。

植物提取物；乙酰胆碱酯酶；抑制剂；活性评价

早老性痴呆症（又称阿尔茨海默氏病，Alzheimer’s Disease, AD）是发生于老年和老年前期以进行性神经退化为特征的大脑退行性病变，是中枢神经系统变行性疾病，其主要临床表现为进行性认知功能减退并伴有行为障碍和情绪异常等，严重者直至失去生活自理能力[1-2]。目前的研究认为AD是一种多病因疾病，胆碱能假说是目前最为被广泛接受的病理理论[3-5]。因此，乙酰胆碱酯酶抑制剂（Acetylcholinesterase Inhibitor, AChEI）药物是目前研究最多、最为活跃的抗早老性痴呆症药物[3-7]。其中最具代表性的中枢神经性可逆AChEI有第一代的Tacrine(商品名：cognex)，Donepezil (商品名：Acricept), Rivastigmine(商品名：Exelon)，以及第二代的石杉碱甲(HupA)等[3]。

自然界具有丰富的生物资源多样性，大量研究表明：天然植物药用成分具有疗效好，副作用小，作用面广，适宜长期服用等优点。因而，从药用植物中寻找具有抗老年性痴呆的乙酰胆碱酯酶抑制剂，已成为当今医药研究方面的热点课题[7-8]。为此，本研究对采自江西井冈山地区的15种植物乙醇提取物的不同溶剂萃取物进行了乙酰胆碱酯酶抑制活性研究，旨在为发现天然乙酰胆碱酯酶抑制剂提供线索。

1 　材料与方法

1.1 　植物提取物样品的制备

本实验所用的植物样品均采自江西井冈山地区，由井冈山大学周兵老师鉴定，模式标本保存于井冈山大学标本馆。新鲜的植物材料阴干，磨碎，取上述每种磨碎的植物样品10 g , 用95％乙醇100 mL浸泡，超声波提取30 min，过滤，反复提取3次，合并提取液，减压浓缩后得乙醇提取物浸膏，将浸膏用分别加入20 mL蒸馏水,再依次加入约30 mL石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次,合并3次萃取液浓缩,分别得石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物，称重,使用前用50％乙醇分别配成40 mg/mL和1 mg/mL浓度(最终测试浓度分别为1 mg/mL和0.025 mg/mL)，备用。

1.2 　仪器

UV2550紫外可见分光光度计(日本Shimadzu公司)，SC215 超级数控恒温槽(宁波天恒仪器厂) ，旋转蒸发仪(瑞士BÜCHI 公司) 。

1.3 　药品与试剂

乙酰胆碱酯酶(AChE，Sigma 公司)，50 mmol/ L、pH 8. 0 的磷酸缓冲盐溶液( PBS)，15 mmol/ L 二硫二硝基苯甲酸(Dithiobisnitrobenzoic acid，DTNB) 溶液(Sigma 公司) (用50 mmol/ L，pH 8.0 PBS配制)，15 mmol/ L 硫代乙酰胆碱(Acetylthiocholine，ATch，Sigma 公司，用50 mmol/ L，pH 8. 0 PBS 配制)，4 %十二烷基硫酸钠( SDS，Sigma 公司) ，阳性对照tacrine (Sigma 公司)，其余化学试剂均为分析纯。

1.4 　实验方法

实验采用改良的Ellman方法[9]进行，简单介绍如下：2.65 mL PBS(pH 8.0)，50 µL AChE (0.85 U/mL，buffer pH 8.0)，100 µL 15mM DTNB 和样品溶液 100 µL加入试管，37 ℃预热 2 min，然后加入100 µL 15 mM ATch，在 37 ℃保温 20 min后立即加入1 mL 0.4％SDS 终止反应，将所得溶液立即在412 nm下测量吸光值并根据下式计算抑制率，

抑制率(％) = [A对照-(A样品-A样品空白)]/ A对照×100

A对照是指样品溶液为没有添加样品的50％乙醇溶液时的吸光值，A样品是指添加样品溶液的吸光值，而A样品空白则表示添加样品溶液但没有添加底物ATch 时的吸光值。所有实验重复3次并计算平均值和标准差，阳性对照为他克林。

2 　结果

2.1 乙酸乙酯萃取物的乙酰胆碱酯酶抑制活性的研究

对15种植物乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物乙酰胆碱酯酶抑制活性的研究表明(表1)：在供试质量浓度在1 g/mL时，部分植物的乙酸乙酯萃取物均表现出一定的乙酰胆碱酯酶抑制活性，中铁扫帚、龙爪槐茎、金银花和女贞叶表现出较强的抑制活性,抑制率均大于70%,其余大部分植物的抑制率均小于40%。在供试质量浓度在0.025 mg/mL时，有接骨木和南方荚蒾的抑制率大于60%，其余大部分植物的抑制活性均小于 30%，至有些植物不仅对乙酰胆碱酯酶没有抑制活性，反而表现出一定的增强作用。

表1 15种植物乙酸乙酯萃取物抑制 AChE活性

2.2 正丁醇萃取物的乙酰胆碱酯酶抑制活性的研究

对15种植物乙醇提取物的正丁醇萃取物乙酰胆碱酯酶抑制活性的研究表明 (表2)：供试质量浓度在 1 mg/mL时，15种植物的正丁醇萃取物均具有明显的乙酰胆碱酯酶抑制活性，其中铁扫帚、龙爪槐叶、龙爪槐茎和金银花茎的抑制率均大于85%，其余大部分植物的抑制率均大于40%。供试质量浓度在0.025 mg/mL时，夹竹桃的抑制率大于80%。其余大部分植物的抑制率均小于40%。

表2 15种植物正丁醇萃取物抑制 AChE活性

2.3 石油醚萃取物的乙酰胆碱酯酶抑制活性的研究

对15种植物乙醇提取物的石油醚萃取物乙酰胆碱酯酶抑制活性的研究表明(表3)：在供试质量浓度在 1 mg/mL时，15种植物的石油醚萃取物均具有明显的乙酰胆碱酯酶抑制活性，其中菜豆、爬山虎叶、南方荚蒾和女贞叶的抑制率均大于90%。供试质量浓度在 0.025 mg/mL时，仍有部分植物表现出较高的乙酰胆碱酯酶抑制活性，其中抑制率大于80%的分别有爬山虎叶、鸡眼草、金银花茎、迎春花茎和叶。

表3 15种植物石油醚萃取物抑制 AChE活性

3 　讨论

随着社会人口的老化，老龄人口不断增加，老年性痴呆症发病率相对上升，目前,全世界约有 1700~2500万的人患有此病[10]，痴呆症与心血管疾病、恶性肿瘤一起已成为老年人致残、致死的三大疾病[11]。然而，从植物中筛选并开发出的抗老年性痴呆症的药物并不多，系统的进行植物乙酰胆碱酯酶抑制活性研究的报道也很少[12]，本实验对采集到的15种植物乙醇提取物的三种溶剂萃取物进行了乙酰胆碱酯酶抑制活性研究，实验结果显示部分溶剂萃取物具有较高的的抑制乙酰胆碱酯酶活性。例如0.25 mg/mL时, 接骨木和南方荚蒾乙酸乙酯萃取物的抑制率大于60%，夹竹桃的正丁醇萃取物抑制率大于80%，爬山虎叶、鸡眼草、金银花茎、迎春花茎和叶石油醚萃取物的抑制率大于80%。另外，在对不同溶剂萃取物的比较中，由正丁醇相和石油醚相抑制率比乙酸乙酯相要高，显示抑制乙酰胆碱酯酶活性成分或许更多的在这两相溶剂中，极性偏小或偏大，而在中等极性溶剂中则较少。表明这些植物萃取物极有可能含有强抑制乙酰胆碱酯酶活性的成分，对这些植物进行系统深入的化学成分研究，很有可能从中发现活性更强的有效成分，从而为防治早老性痴呆症的药物研究提供有价值的活性先导结构。这些植物的进一步的活性追踪、化学成分分离与结构鉴定工作仍在进行中。另外，在乙酰胆碱酯酶抑制活性的研究中，我们研究发现，部分低浓度提取物对乙酰胆碱酯酶活性不但没有抑制作用，反而有一定的增强作用，这种现象在海藻组分[12]和蕨类植物[13]中亦被观察到，我们的研究进一步证明了这种现象的存在。

[1] Jann M W. Preclinical pharmacology of metriphonate[J]. Pharmacotherapy, 1998,18: 55-67.

[2] Aisen P S, Davis K L. The search for disease-modifying treatment for Alzheimer’s Disease[J]. Neurology, 1997, 48: 35-41.

[3] Ma X Q, Tan C H, Zhu D Y, et al.A survey of potential huperzine A natural resources in China the Huperziaceae[J]. J Ethnopharm, 2006, 104: 54-67.

[4] Paraoanu L E, Steinert G, Klaczinski J, et al. On functions of cholinesterases during embryonic development[J]. J Mol Neurosci., 2006, 30 (1): 201-204.

[5] Duysen E G, Lockridge O. Phenotype comparison of three acetylcholinesterase knockout strains[J]. J Mol Neurosci., 2006, 30 (1): 91-92.

[6] Silveyra M X, Garcia-Ayllon M S, Calero M, et al. Altered glycosylation of acetylcholinesterase in the creutzfeldt-jakob cerebrospinal fluid[J]. J Mol Neurosci, 2006, 30 (1): 65-66.

[7] Ma X Q, Gang D R. The Lycopodium alkaloids[J]. Nat Prod Rep, 2004, 21: 752 - 772.

[8] Oh M H, Houghton P J, Whang W K, et al. Screening of Korean herbal medicines used to improve cognitive function for anti-cholinesterase activity[J]. Phytomedicine, 2004, 11: 544-548.

[9] Perry, N S L, Houghton, P J, Theolad, A, et al. In vitro inhibition of human erythrocyte acetylcholinesterase by Salvia lavandulaefolia essential oil and constituent terpenes[J]. J. Pharm. Pharmacol., 2000, 52: 895-902.

[10] Mayeux R, Sano M. Treatment of Alzheimer's disease[J]. N Engl J Med, 1999, 341: 1670-1679.

[11] Hebert L E, Scherr P A, Bienias J L, et al. Alzheimer disease in the US population prevalence estimates using the 2000 Census [J]. Arch Neurol, 2003, 60: 1119.

[12] 张翼, 冯妍, 李晓明, 等. 海藻组分抑制乙酰胆碱酯酶活性研究[J]. 海洋与湖沼, 2005, 36( 5): 459-464.

[13] 殷帅文, 黄凤春, 张圆圆, 等.不同蕨类植物提取物乙酰胆碱酯酶抑制活性的评价[J]. 天然产物研究与开发, 2009, 21 (5): 854-857.

PRIMARY STUDY ON THE ACETYLCHOLINESTERASE INHIBITORY ACTIVITY OF DIFFERENT PLANT EXTRACTS

*YIN Shuai-wen1,2, LIU Li-ping1, WANG An-ping1,2, MAO Kai-jun1, XIONG Xin1

(1. School of Life Sciences, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China;2. Key Laboratory for Biodiversity Science and Ecological Engineering of Jiangxi Province, Ji’an, Jiangxi 343009, China)

To research of acetylcholinesterase (AChE) inhibitory activity of 15 plant extracts which collected from Jinggangshan, Jiangxi Province, model of acetylcholinesterase inhibitory activity were used. The results showed that,as ethyl acetate soluble fractions, most of the 15 plants had high inhibitory activity to AChE under the concentration of 1 mg/mL, in which more than 70% inhibiting rates were for,,and, more than 40% for the other plants. However, under the concentration of 0.025mg/mL, the extracts of the most plants had low inhibition rate less than 30%, except thatandhad more than 60% inhibiting rates. As-butyl alcohol soluble fractions, most 15 plants had high inhibitory activity to AChE under the concentration of 1 mg/mL, more than 85% inhibiting rates for,and, and onlyhad more than 80% inhibiting rates under the concentration of 0.025 mg/mL. As petroleum ether soluble fractions, most 15 plants also had high inhibitory activity to AChE under the concentration of 1 mg/mL, 4 plants such as,andhad more than 90% inhibiting rates, 4 plants. still had more than 80% inhibiting rates under the concentration of 0.025 mg/mL. On the contrary, some plant extracts even enhanced this enzyme.

plant extracts; acetylcholinesterase (AChE); inhibiting rates

R931.77/R282.71

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2012.04.012

1674-8085(2012)04-0052-05

2012-03-24；

2012-06-06

国家自然科学基金项目（30760031）；江西省自然科学基金项目（20114BAB204025）；江西省生物学高水平学科项目

*殷帅文(1978-)，男，湖南宁乡人，副教授，博士，主要从事天然产物研究与开发(E-mail: shwyin@126.com);

刘丽萍(1988-)，女，江西吉安人，井冈山大学生命科学学院本科生(E-mail: llp@126.com);

王安萍(1971-)，女，江西吉安人，实验师，硕士，主要从事天然产物研究与开发(E-mail: jgkwangap@hotmail.com);

毛恺俊(1990-)，男，江西吉安人，井冈山大学生命科学学院本科生(E-mail: mkj@126.com);

熊 欣(1990-)，男，江西吉安人，井冈山大学生命科学学院本科生(E-mail: xx@126.com).