CTV侵染对锦橙叶片营养元素含量的影响研究

张文玲，刘丹

（重庆三峡职业学院 农林科技系，重庆 万州404155）

柑橘衰退病毒（Citrus tristezavir us，CTV）是长线性病毒科，长线性病毒属的一种正义单链RNA病毒，能够侵染大多数的柑桔种、杂种及其近缘种，由它引起的柑桔衰退病是对全球柑橘生产破坏性最强的病害之一，是威胁我国柑橘生产的三大主要病害之一，该病广泛分布于世界各柑橘产地，对全世界的柑橘产业造成了严重威胁。CTV侵染之后的植株有的不会产生症状［1］，根据植株表现出的症状类型目前主要分为速衰、茎陷点、苗黄和脉明四种。病株可表现单一症状或复合症状。其中茎陷点会引起来檬、葡萄柚、柚和甜橙茎干木质部凹陷（茎陷点或沟）、树势衰退、矮化、发育迟缓、果实畸变、品质下降［2］。我国从20世纪90年代开始大力发展甜橙和柚类品种，茎陷点型病毒株系对感病甜橙品种为害日益成为比较突出的问题。

目前，营养元素分析已经广泛应用于梨［3］、苹果［4］、扁桃［5］、李［6］、枇杷［7］以及柑桔［8］等果树研究中，但关于病毒侵染引起对果树的营养生理影响的报道较少［9］。锦橙作为我国南方的一种重要果树，易被CTV侵染，目前关于CTV侵染柑桔对其叶片营养造成的影响的研究还没有，因此本实验希望通过研究实验条件下锦橙被CTV侵染后的植株变化及CTV对营养元素含量变化的影响，以期为生产上矫治锦橙的衰退病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选择两年生温室盆栽实生锦橙，长势良好且基本一致。采用嫁接法进行接毒。在嫁接前浇水至盆土水分饱和。然后将植株分为两组：一组5株，每株嫁接无毒枝条的皮2个，芽1个作为对照组，分别标记为1到5号；其余9株嫁接感染CTV强毒株Trl514的枝条的皮2个，芽1个，标记为6到14号。嫁接后去除顶端枝条，接穗抽生后剪去多余枝条。

1.2 实验方法

1.2.1 CTV侵染鉴定

根据Gar nsey等的方法［10］对采集的样品进行检测接毒株用直接组织印迹免疫法（Direct Tissue Blot Immuno－Assay，DTBIA）DTBIA 初筛，之后利用采用RT－PCR法对接种CTV的锦橙叶片RNA进行CTV毒性检测（引物序列为：上游引物：5＇－CTTCCAACAATACGCAGTCTCAG－3＇下游 引 物：5＇－GAAGATCTCCGCCGGAAACACTCAGAC－3＇，目标片段614 bp），另外还分别抽提了接毒后1、2、3、4、5和6个月时叶片的RNA做反转录后检测CTV（引物序列为：上游引物：5＇－TTAACGGGGTGACCAAGACG－3＇；下游引物：5＇－TTCCAAACCAAACCGACACAG－3＇，目标片段182 bp）。

1.2.2 样品的采集和前处理

取当年生春梢营养枝顶部第3叶，对照和处理锦橙叶片各120片，装入有孔的干净塑料袋，置冰盒中，带回实验室；先用自来水加入0.1%中性洗涤剂清洗叶片正反两面，再用自来水清洗3次，然后置于0.2%盐酸溶液浸泡30 s后用自来水冲洗2次，最后再用去离子水清洗3次，置于烘箱中105℃杀酶30 min，然后75～80℃烘干，粉碎、密封，置干燥器中保存待测。

1.3 营养元素含量测定

样品经前处理后，氮元素含量按LY／T 1269－1999方法，浓硫酸消解，在KDY－9820凯氏定氮仪上测定；磷、钾、钙、镁、铁、锰、铜和锌等8种元素按LY／T 1270－1999方法，硝酸－高氯酸消解，磷用TU－9101双光速紫外可见分光光度计在700 n m波长下测定；钾、钙、镁、铁、锰、铜和锌元素用AA－800原子吸收分光光度计测定；B含量按LY／T 1273－1999方法，干灰化法，用TU－9101紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）在430 n m波长下测定。重复测定3次。

2 结果与分析

2.1 接毒锦橙症状表现

观察接种了CTV的锦橙（图1）发现：9株接毒锦橙中有两株呈现顶梢枯死，叶片出现黄化现象，茎剥去枝条皮层后可以看到茎陷点。另外由于温室通风不良、湿度较大及温度偏高等原因，接种CTV的锦橙叶片大片呈现煤烟病症状，而在无毒嫁接的锦橙上则没有出现煤烟病症状。

图1 CTV侵染后植株症状Fig.1 Symptoms of Jinchen orange after CTV infection

2.2 CTV检测结果

2.2.1 DTBIA检测结果

在每个植株上各取3个叶片做直接组织印迹免疫法（Direct Tissue Blot Immuno－Assay，DTBIA）DTBIA分析，DTBIA分析，所有接毒的9株锦橙均呈现CTV阳性。6～9号植株染色较深，而10～14号显色较浅。

图2 DTBIA检测结果Fig.2 Electrophoresis result of CTV detection

2.2.2 RT－PCR检测结果

为了更精确的确定CTV侵染情况，我们又用Trizol法分别提取了每个植株的总RNA，应用Trans Gen Biotech公司生产的反转录第一链c DNA合成录试剂盒（T301－02）进行反转录后PCR检测。结果见图3，可看出所有接毒植株均呈现CTV阳性。接毒后的1个月、2个月、3个月、4个月、5个月和6个月的CTV检测情况如图4所示。

2.3 营养元素的含量状况

通过t测验比较两组锦橙之间的元素含量发现，接种了CTV的锦橙中氮、钾、铜含量与对照相比差异极显著；而钙、硫、硼、铁、锰和锌的含量低于正常嫁接的锦橙，差异极显著；磷、镁的含量相差不大。且相对于叶片营养诊断标准［11］氮、磷、钾的量都过高。其中硼、锰、铁、钙和锌元素含量差异较为明显。

图3 CTV检测结果Fig.3 Electrophoresis result of CTV detection

图4 CTV检测结果Fig.4 Electrophoresis result of CTV detection

表1 锦橙叶片营养元素含量状况Table 1 Status of nutrient contents in Jincheng orange leaves

3 结论与讨论

本实验成功对锦橙进行了接毒，鉴于CTV颗粒很长［11］，发生断裂后易失去侵染能力且通过汁液摩擦接种的成功率很低，故采用嫁接法进行接毒。接毒成功率为100%。观察接毒后锦橙症状，叶片出现黄化现象，茎陷点较为明显。另外，还有2株接种了CTV的锦橙出现了顶梢枯死现象。接种了CTV强毒株TRL 514的锦橙植株还感染了煤烟病，而接种无毒枝条皮和芽的锦橙则没有感染煤烟病，这种情况的产生可能类似于感染了艾滋病后免疫力低下相似。植物体由于CTV的侵染，免疫能力下降，因而感染其他一些真菌性、细菌性和病毒性病害的几率也变大。

通过营养元素分析还发现：接毒锦橙中硼、锰、铁、钙和锌元素含量低于无毒嫁接的锦橙且差异比较明显，在一定程度上可以反映出CTV侵染对植株营养状况的影响。硼含量的降低说明接毒锦橙由于CTV的侵染，细胞衰亡速率加快，同时硼含量的降低也使得植株更易产生光抑制现象。锰、铁、钙、锌含量的降低可以说明CTV的侵染影响了植株氧化还原、呼吸、光合作用等过程，对植株的生长发育产生影响。CTV侵染的锦橙中铜含量相对于无毒嫁接锦橙要高，可以反映出CTV侵染影响到植株呼吸作用。另外铜对氮素代谢亦有影响，通过比较可以看出，氮和铜在接毒植株中的量均高于无毒嫁接锦橙。

综上，可以看出CTV的侵染严重影响了锦橙表型、营养运输并最终影响一系列的生理生化过程。

通过本实验研究可以发现，CTV的侵染严重影响了锦橙的正常生长，其营养元素含量也因CTV的侵染发生改变，然而，由于本实验只是研究了实验室条件下CTV侵染对植株的影响，因此还不能代表田间情况。实验条件下营养元素的差异表现出植株对于CTV侵染所作出的应答。本实验在一定程度上可以反映出CTV导致锦橙植株形成茎陷点（沟）对营养元素吸收的影响。可以为今后CTV的预防和诊断提供一定的理论依据，尤其是营养元素的变化也可以做为日后研究CTV影响的重要指标。在今后的研究中，还可以通过结合抑制性差减杂交（SSH）技术以及基因芯片等技术研究CTV应答基因，进而从分子水平揭示CTV侵染对植株的影响。

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