珍珠粟响应水杨酸处理的基因表达谱分析

张莉，于浩泉，高德鹏，王晓东，和天天，苏曼琳，韩渊怀

（1.山西农业大学 生物工程研究所，山西 太谷030801；2.北京林业大学 林学院，北京100083）

珍珠粟（Pennisetum glaucum）属于禾本科黍族狼尾草，为粮食饲料兼用的一年生草本植物，又称蜡烛稗或御谷。珍珠粟在谷类中被认为是世界上第六大重要热带食物，其主要生长在非洲西部和印度等半干旱地区。在贫瘠的沙土和干旱地区，珍珠粟是唯一可靠的粮食和饲料作物；在非洲和亚洲的干旱地区，珍珠粟是主要的粮食作物；在南美等热带和亚热带地区，珍珠粟被广泛的用于夏季牧场作物［1］。

作物的产量在很大程度上会受一些环境条件的影响，如干旱、高温、低温、高盐等。作物在这些非生物因子的胁迫下，会产生各种不同的生理和分子响应，包括基因表达、新陈代谢、渗透压调节、诱导修复系统改变，以及对于病菌侵染时的响应等，这些过程影响着作物的分布、生长和产量。早在1985年，Guy等就通过研究在低温条件下基因的表达变化，以了解植物中的非生物胁迫应答通路［2］。通过不同的文库筛选，研究者在拟南芥中发现了RD29A等脱水应答基因。不久，研究者又通过单酵母杂交系统发现，脱水应答元件结合因子（DDREB）结合于RD29A启动子的脱水应答元件（DRE）上［3，4］。使用相似的方法，在拟南芥中发现了一系列低温应答基因［5］。前期关于胁迫相关通路的研究主要以前基因组时代的表达谱方法为主，如：先进行不同文库的筛选，再进行分子和生物学功能分析的方法。以全基因组表达谱为代表的表达谱芯片技术为全基因组表达研究提供了可能。Kreps等通过包含约8000个基因的表达谱芯片，研究了拟南芥在受到伤害胁迫时的表达谱变化。研究表明，其中17个受伤害等生物胁迫诱导的基因，在低温、干旱、高盐和ABA处理的非生物胁迫条件下也会受到诱导，这些基因包括经常出现在非生物胁迫应答中的CBF1和CBF2基因和一些水通道蛋白，而大多伤害应答基因与病菌应答通路中的基因一致［6～8］。

除了非生物胁迫外，病菌、害虫、寄生植物等生物胁迫对植物的产量也有着很大的影响。已有研究表明，植物的病菌抗性可以被茉莉酸（JA）、水杨酸（SA）、乙烯（ET）和硫代葡萄糖苷及他们的水解产物等调节。生物胁迫往往会引起JA、SA、ET等相关信号通路的变化，JA、SA、ET等会作为信号分子来激发一些植物的抗性反应，来响应或抵抗外来的生物胁迫。通过研究拟南芥的c DNA表达谱分析研究表明，在拟南芥受到黑斑菌侵染或用防卫相关信号分子，如：SA、茉莉酸甲酯（MeJA）、ET等一种或多种处理下，705个mRNA分子的表达都发生了变化，其中包括已知的及预测的防卫相关基因和106个还没有任何功能或同源注释的基因。调节防卫反应的169个基因可以被多种处理或防卫通路调控。在SA和MeJA处理后，一些基因表现为共诱导或共抑制，可见在植物的防卫反应中，不同的防卫信号通路水杨酸和茉莉酸通路存在相互或协调调节网路［9］。Rayapuram等通过分析烟草在受到动物伤害时JA和SA的水平来研究生物胁迫对防御系统的影响。研究表明，当用SA处理烟草时，Na NPR1基因的转录水平会升高，而当将Na NPR1基因沉默，植物就更易受到动物和病菌伤害的影响。通过生物芯片分析表明，在NPR1基因沉默的植物中，一些JA诱导基因下调，而一些SA合成基因上调。所以，可以推断，当植物受到动物伤害时，NPR1基因调控SA的产生量，进而引起JA介导的防御反应，在NPR1基因沉默的植物中，SA产量增加，JA相关防御减弱使得植物更易受到动物的影响［10］。

在所有谷类作物中，珍珠粟是最耐热和干旱的植物。即使在高温和干旱环境下，珍珠粟相对于玉米，甚至高粱，仍会有较高产量［11］。虽然珍珠粟相比玉米与高粱具有更好的抗病害能力，但其产量也会受到病害的影响，其中一种病害就是由寡纹柄锈菌（Puccinia substriata，P.substriata）导致的锈病。本文通过分析珍珠粟在受到SA处理后，与寡纹柄锈菌下共表达的基因，来分析SA处理对生物胁迫的影响，为防治病菌提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本文所分析的基因芯片数据来源于NCBI中的 GEO数据库（http：／／www.ncbi.nl m.nih.gov／geo／），序列号为 GSE13481。该c DNA 文库由Van den Ber g等人创建［12］，是珍珠粟中对各种防御响应的基因芯片序列。在1920个c DNA中，有355个c DNA在胁迫响应中进行差异表达。Van den Berg等将其中135个在SA和MeJA处理下差异表达最显著的c DNA挑选出来进行测序，得到的序列信息在NCBI上比对，得到66个非重复序列。这些c DNA序列储存在GENBANK db EST数据库中，序号为GD180624～GD180688。

1.2 试验方法

1.2.1 聚类分析与共表达分析

将Van den Ber g等比对到的各物种GI号，间接比对到拟南芥的基因上，对其中的所有基因进行聚类分析，采用Spear man秩相关分析，质心连锁的聚类方法得到表达数据的聚类。同样利用Spear man秩相关，检验各个基因间的相关系数（p＜0.05）构成相关关系网络图。

1.2.2 差异基因分析与功能注释

利用超几何分布对上调和下调的差异基因进行功能注释分析，Fisher精确概率检验计算P值，Benjamini－Yekutieli方法对多重检验结果进行校正，筛选其中表达差异2倍及以上，并且FDR＜0.05富集的Go Terms。

2 结果

2.1 聚类及共表达分析

水杨酸和寡纹柄锈菌处理后，对珍珠粟中差异表达2倍或以上的c DNA进行层次聚类分析（图1），结果表明，相较于不同处理下的样本表达概型，每种处理内部的时序样本表达概型之间更加相近。

图1 水杨酸和寡纹柄锈菌处理后，珍珠粟中c DNA差异表达2倍或以上的层次聚类分析Fig.1 Hierarchical cluster of sequenced pearl millet c DNAswitht wofold or more changes in transcript abundance in response to SA or Puccinia substriata treat ment

同样利用Spear man秩相关检验各个基因间的相关系数（p＜0.05）构成相关关系网络图（图2）。由 图 可 见 GAPC1，LOS2，ALF5，HSP70，RD22等基因有显著的共表达关系，他们共同参与了化学刺激响应和胁迫响应等多种生物过程。AT 1G54290、AT 5G60390、ALAAT 2、AT 3G14770、LOS2、GAPC1等基因均与其他多个基因有共表达关系，预示着这些基因在植株各种生物过程中可能发挥重要作用。

2.2 差异表达基因分析

由表1可以看出，经SA处理过的植株，其体内多个与胁迫相关的基因表达量显著上调，这些基因有 HSP70、ALF5、AT1G66100、PPC2、PGK、LOS2、 GAPC1、 AT4G24690、 AT1G54290、AT3G14770、RD22和NPQ4。

表1 差异基因列表（相对于t＝0 h的差异倍数（比值））Table 1 Differential expression genes in pearl millet（relative to t＝0 h）

图2 共表达网络分析图Fig.2 Co－expression net wor k analysis

2.3 差异基因的功能注释

利用超几何分布对上调和下调的差异基因进行功能注释分析，Fisher精确概率检验计算P值，并用Benjamini－Yekutieli方法［13］对多重检验结果进行校正，筛选其中表达差异2倍及以上，并且FDR＜0.05富集的GoTerms（表2、表3）。

表2 上调基因集在GO在生物学过程中的注释分析（前10个）Table 2 GO Ter ms enrich ment analysis in biological process with the up－regulated genes（top 10）

表3 下调基因集在GO在生物学过程中的注释分析（前10个）Table 3 GO Ter ms enrich ment analysis in biological process with the down－regulated genes（top 10）

3 结论与讨论

病原体在宿主植株上的是否能成功发挥毒性体现在病原体逃避或者操作宿主反应的能力上［11～14］。SA预处理提高了植株对锈病侵染的耐受性，说明SA诱导出的防御反应相关基因表达在植株对锈病侵染的抵抗过程中发挥着重要的作用。我们推测P.substriata病毒在侵染的过程中可以成功抑制宿主体内SA诱导的防御反应。我们观察到可能的SA介导的防御关键基因包括HSP70、AT3G25570、ALF、AT1G66100、PPC2、PGK、ALAAT2、LOS2、GAPC1、AT4G24690、AT5G60390、AT1G54290、AT3G14770、RD22 和NPQ4。这些基因在病毒侵染过程中被抑制或者没有被诱导。它们很可能成为病原体在植株中产生毒性效应的可操作的靶标，这与以往研究描述一致［15］。

SA预处理过的植株诱导出若干差异表达基因在多种应急响应过程中发挥重要作用，包括盐胁迫响应、温度刺激响应、渗透胁迫响应、化学刺激响应、干旱响应、毒素响应、脱落酸响应、病毒响应、有机质响应等，说明众多应激响应有部分类似的机制。其中共同高频出现的基因包括：LOS2、GAPC1、NPQ4、ALF5、AT1G66100、HSP70 和RD22。这些关键基因多分布于细胞膜、细胞外周和胞间部分。病毒介导的基因沉默技术证明，HSP70基因是植物防御信号转导通路的重要成分［16］。LOS2是一个响应冷胁迫的基因，在植物抗冻响应中具有重要的作用［17］。RD22是一个脱水应答基因，其表达受脱水、高盐、ABA诱导，但不受冷、热胁迫诱导［18］。

在差异表达的基因中，ADR1－L 1、AVP1、AT4G02610、AT1G62290、RPT2A、T15 M6、HRE1、BGLU11、AT3G27210、PR1、UGT 74F1 和SCPL 6都不同程度的在P.substriata病毒接种植株中的表达量高于SA预处理的植株。尤其是若干基因看似由SA介导，但却在P.substriata病毒接种植株中表现出极高的表达量，例如：编码病程相关蛋白的基因PR1（表达量上调接近50倍），编码UDP糖基转移酶74F1的UGT 74F1基因（表达量上调70多倍）及编码丝氨酸羧基肽酶类6的SCPL6基因（表达量上调近92倍）。

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