民族药金耳环多糖的提取和含量测定

魏学军，林先燕，夏亚兰，刘文兰，李 江

民族药金耳环多糖的提取和含量测定

*魏学军1，林先燕1，夏亚兰1，刘文兰1，李 江2

（1. 黔南民族医学高等专科学校，贵州，都匀 558003；2. 贵阳中医学院，贵州，贵阳 550001）

探讨建立金耳环多糖的提取和含量测定方法。采用水提醇沉法从金耳环药材中提取并分离出粗多糖，经除杂、脱蛋白、脱色及脱脂纯化后，用分光光度法测定多糖含量。金耳环精制多糖得率为1.579 0%，多糖质量分数为99.95% ，RSD为0.70%。该方法简单、快速、灵敏度高、重复性好，可用于金耳环多糖的含量测定。

金耳环；多糖；提取；含量测定

金耳环为马兜铃科植物金耳环的干燥全草，主要分布在江西、广东、广西等地。金耳环具有温经散寒，祛痰止咳，散瘀消肿，行气止痛的功效，其所含成分包括黄酮类、氨基酸、糖类和挥发油等[1]。由于疗效显著，采集方便，在贵州三都水族集聚地被广泛的用于风寒感冒、慢性支气管炎、风寒痹痛、跌打损伤、细菌性痢疾等症候的治疗，水药记载名为骂广瓦[2]。其所含多糖类成分是中草药中重要的活性物质，对止咳祛痰、抗衰老、抗病毒、抗肿瘤、降血糖和降血脂等有显著疗效[3-4]，目前有关金耳环多糖的研究未见文献报道。课题组同期实验研究发现金耳环具有止咳祛痰[5]、止血的药理作用，后续实验验证其所含多糖类成分是产生上述作用的重要活性部位（待发表），故对金耳环多糖的提取及含量测定进行研究，以期为建立金耳环的质量控制标准和开发应用提供相关理论依据。

1 仪器与试药

Cary 100型双光束紫外可见分光光度计（安捷伦科技有限公司）； Mettler AE 240电子天平（瑞士）；DW-60W156超低温冰箱（青岛海尔）；DHG - 9240A真空干燥箱（上海金山）；2.0R大容量低速离心机（德国Heraeus）。葡萄糖标准品（中国食品药品检定所，批号：110833–200904），其他试剂均为分析纯。金耳环药材采于贵州三都水族自治县境内，经贵阳中医学院李江教授鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 金耳环多糖的提取与精制

取 60 ℃恒温干燥的金耳环10 g，充分浸渍，回流提取2次，每次l h。合并滤液并浓缩，加入无水乙醇使含醇量至80%，静置24 h。倾去上清液，沉淀用去离子水溶解，反复冻融除杂至无沉淀，Sevage 法除蛋白质至无游离蛋白(多糖溶液在280 nm处无紫外吸收)，H2O2(15%)脱色。过滤，加入无水乙醇使含醇量至80%，静置24 h，倾去上清液，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚多次洗涤，除去其脂溶性成分。于60 ℃减压干燥，称重得精制多糖0.157 9 g，得率为1.579 %[6-7]。

2.2　金耳环多糖的鉴别

取金耳环多糖2 mg，用蒸馏水10 mL溶解后精密吸取1 mL至具塞试管中，加入1mL α-萘酚溶液，混匀后沿试管壁加入浓硫酸溶液1 mL，静置观察。实验结果表明，液面交界处有金耳环多糖棕红色环状阳性反应。

2.3 金耳环多糖样品溶液的制备

精密称取金耳环精制多糖20 mg，定容于100 mL量瓶中，再吸取上述溶液1.0 mL定容至10 mL，摇匀得样品溶液。

2.4 标准曲线的绘制

2.4.1 葡萄糖标准溶液的制备

精密称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖对照品10 mg，置于100 mL量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，配制成100 μg·mL－1的标准葡萄糖溶液备用。

2.4.2 最大吸收波长的确定

精密吸取配制的20 μg·mL－1标准葡萄糖溶液和40 μg·mL－1精制金耳环多糖溶液各1.0 mL，分别加入5%苯酚溶液1.0 mL，再迅速沿管壁加入5.0 mL浓硫酸，摇匀，静置5 min，置沸水浴中加热15 min，再置冷水浴中10 min，补充失去的水分至刻度。另以1.0 mL蒸馏水同法操作作为空白对照，在450~530 nm扫描，确定最大吸收波长。实验结果表明，葡萄糖和金耳环多糖均在496 nm处有最大吸收。

2.4.3 标准曲线的绘制

精密吸取“2.4.1”项下标准葡萄糖溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL分别加于20 mL的具塞试管中，并分别加蒸馏水补至2.0 mL，配制成5，10，20，30，40，50 μg·mL－1的葡萄糖标准系列溶液，另取2. 0 mL蒸馏水作为空白对照。用“2.4.2”方法显色后，在最大吸收波长496 nm处测定吸光度，以吸光度()为纵坐标，以葡萄糖标准溶液质量浓度(，μg·mL－1) 为横坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。得标准曲线的回归方程:= 0.013 6－0.065 9，= 0.999 4。

2.5 换算因子的测定

精密称取60 ℃干燥恒重的精制多糖20 mg，置于100 mL量瓶中定容。再吸取上述溶液1.0 mL定容至10 mL。吸取2.0 mL上述溶液按“2.4.2”方法显色后，在496 nm处测定吸光度，按下式计算换算因子：

= W/( C × D )

式中: W 为多糖质量( mg ) ，C 为多糖液中葡萄糖的浓度(μg.mL－1) ，D为多糖的稀释倍数。测得换算因子= 1.337 3，RSD = 1.32% (= 3)。

2.6 稳定性试验

精密吸取金耳环多糖样品溶液1.0 mL，按测定标准曲线的方法，分别在 0.5，1，2，4，8，16，24 h 处测定吸光度，实验结果表明，在24 h时吸光度开始下降，说明多糖溶液在16 h以内比较稳定，RSD为1.87%(前5次)。

2.7 精密度试验

精密吸取金耳环多糖样品溶液1.0 mL，按测定标准曲线的方法，连续测定6次，其吸光度平均值0.136 1，RSD为1.23%，表明此方法精密度良好。

2.8 重复性试验

精密吸取金耳环多糖样品溶液1.0 mL 6份，按测定标准曲线的方法测定吸光度，RSD为1.64%，重复性良好。

2.9 回收率试验

精密吸取金耳环多糖样品溶液1.0 mL共6份，置于20 mL试管中，分别精密加入10 μg.mL－1葡萄糖标准溶液1.0 mL，按测定标准曲线的方法操作，计算回收率。结果平均回收率为99.96 %，RSD为0.42%（= 6）。

2.10 样品中多糖含量的测定

精密吸取金耳环多糖样品溶液1.0 mL，按标准曲线制备的方法测其吸光度值，代入回归方程计算葡萄糖质量浓度(μg·mL－1) ，按下式计算多糖质量分数:

多糖质量分数% = C × D ×/W × 100%

其中，C 为样品液的葡萄糖质量浓度(μg·mL－1)，D 为样品的稀释倍数，为换算因子，W 为样品的质量(mg)。测定结果见表1。

表1 多糖质量分数（n = 6）

3 讨论

本实验采用水提醇沉法提取金耳环粗多糖，经分离纯化后得精制多糖；然后采用分光光度法在实验确定的最大吸收波长496 nm处测定多糖含量并计算多糖质量分数。由实验结果可知精制多糖得率为1.579 0%，多糖质量分数为99.95%，RSD为0.70%，说明按上述提取方法所得的多糖纯度较高。该方法简便可靠，灵敏度高，稳定性和重复性好，可用于金耳环多糖的提取和含量测定，亦可为金耳环多糖的其他药效学研究提供理想的实验用药。

课题组在预实验研究中发现，纯化工艺是影响多糖得率的重要因素之一。冻融除杂和Sevage 法除蛋白质次数超过3次以后，随着次数的增加，多糖得率总体呈下降趋势，多糖质量分数提升不明显，故本实验中冻融除杂和Sevage 法除蛋白质次数均固定为3次，这与张晓莉[7]等研究结果提出的10次以上具有明显的差异。对其他影响因素，如提取工艺等研究，将继续探讨。

本实验是以贵州三都水族自治县境内所采金耳环为样本，考虑到不同地区气候、海拔、土壤、植被状况以及采收时间的不同，含量测定结果是否适用于其他地区，有待进一步研究。

[1] 中华本草编委会.中华本草(第8卷)[M]. 上海:上海科学技术出版社,1999: 504 - 505．

[2] 司有奇,陆龙辉.中国水族医药宝典[M].贵阳：贵州民族出版社，2007:318.

[3] 田庚元,冯宇澄,林颍.植物多糖的研究进展[J].中国中药杂志,1995,20(7):441.

[4] 申利红,王建森,李雅,等.植物多糖的研究及应用进展[J].中国农学通报，2011，27(2):349 - 352.

[5] 夏亚兰,魏学军,林先燕,等.水药骂广瓦提取液对小鼠止咳祛痰作用的实验研究[J].重庆医学，2012，41(10)：966 - 967.

[6] 宋晶，吴启南.芡实多糖的提取及含量测定[J].辽宁中医,2010,37(7):1331 - 1333.

[7] 张晓莉,李玉婷,王亚贤,等.红花多糖的提取与含量测定[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(7):19 - 21.

EXTRACTION AND DETERMINATION OF POLYSACCHARIDES FROM ASARUM INSIGNE

*WEI Xue-jun1, LIN Xian-yan1, XIA Ya-lan1, LI Wen-lan1, LI Jiang2

(1. Qiannan Medical College for Nationalities, Duyun, Guizhou 558003, China ;2. Guiyang College of TCM, Guiyang, Guizhou 550001, China)

To establish the method for extraction and determination of polysaccharide form. The crude polysaccharide was obtained by water extraction and alcohol sink method from, after removing impurity, taking off the protein, decoloring and skimmed purification, its content was determined by spectrophotometry. The receiving rate of refined polysaccharide fromis 1. 5790%, its mass fraction is 99. 95% and RSD is 0. 70%.This method is simple, rapid, has high sensitivity and good repeatability. It can be used for content determination of the polysaccharide in.

asarum insigne; polysaccharide; extraction; content determination

R29

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2012.06.019

1674-8085(2012)06-0086-03

2012-05-12；

2012-08-28

贵州省优秀科技教育人才省长专项资金项目(黔省专合字2010156号)；贵州省黔南州科技局中药现代化专项资金项目(黔南科合社字201018号)

*魏学军(1972-），男，四川成都人，副教授，主要从事中药质量控制研究(E-mail：qndywxj@163.com);

林先燕(1972-），女，贵州平塘人，副教授，主要从事天然植物预防保健研究(E-mail：lxyyz2000517@163.com);

夏亚兰(1980-），女，贵州遵义人，讲师，主要从事天然药物的药效学研究(E-mail：xiayalan10@163.com);

刘文兰(1990-），女，湖南邵阳人，硕士生，主要从事中药质量控制研究(E-mail：270066307@qq.com);

李 江(1973-），男，四川江津人，教授，博士，硕士生导师，主要从事天然药物应用于开发研究(E-mail：lj2005zy@163.com).