枸骨叶中熊果酸的提取工艺研究

李开泉，曾晓敏

枸骨叶中熊果酸的提取工艺研究

*李开泉1,2，曾晓敏3

（1. 江西省天然药物活性成分研究重点实验室，江西，宜春 336000; 2. 宜春学院化学与生物工程学院，江西，宜春 336000;3.宜春学院教育科技园，江西，宜春 336000）

研究枸骨叶中熊果酸的最佳提取工艺条件。在单因素试验的基础上,采用正交试验设计法,选择乙醇浓度(A)、固液比(B)、提取时间(C)为因素,每因素各取三水平,按L9(34)正交表进行实验。结果表明:影响提取效果各因素为乙醇浓度>提取时间>固液比。其最优提取工艺条件为用8.5倍量φ=95 %乙醇,于80 ℃加热回流提取2次,第一次2 h，第二次1.5 h。

枸骨叶；熊果酸；提取工艺；正交实验

枸骨叶为冬青科植物枸骨()的干燥叶，又名枸骨刺、老虎刺、八角茶等，主产于浙江、江苏、河南、湖北、湖南、安徽、江西、福建等地。枸骨叶味苦，气凉，无毒。补肝肾，养气血，袪风湿。主治肺劳咳嗽，腰膝痿弱，风湿痹痛，跌打损伤[1]，民间常用枸骨叶加工成苦丁茶食用。现代研究表明，枸骨叶主含熊果酸类、黄酮类、甾醇类等化学成分，其熊果酸类成分具有抗肝炎、抗肿瘤、抗病毒、抗炎抑菌及降血脂、血糖等多种药理活性，可用于治疗冠心病心绞痛和高血压症及内分泌系统的肥胖症等[2-4]。枸骨叶提取物良好的药用价值、丰富的植物资源和广阔的应用前景引起了国内外学者的热点关注[5]。为了寻找适合于批量生产熊果酸的植物原料，我们对枸骨叶进行了提取分离实验。

1 材料与方法

1.1 材料试剂

枸骨叶，采于江西省宜春市，经江西省天然药物活性成分研究重点实验室鉴定为冬青科植物枸骨()；甲醇(色谱纯)购于上海陆忠试剂厂，95 %乙醇(食用级)，广西糖厂产；活性炭(分析纯)，上海豪申化学试剂有限公司生产；熊果酸对照品，由中国药品生物制品检定所提供。

1.2 仪器设备

Waters-515型双泵高效液相色谱仪，2996光电二极管矩阵检测器(美国)；Perkin-Elmer傅立叶变换红外光谱仪(美国)；显微熔点测定仪(北京)；WZZ-1S数字式自动旋光仪(上海)。

1.3 试验方法

将干燥的枸骨叶粉碎成粗粉(60目),用石油醚浸泡脱脂24 h，滤去石油醚，药渣挥干溶剂后，加乙醇回流提取，提取液减压回收乙醇得浸膏。浸膏用水沉降，离心得提取物。提取物得率按下式计算:枸骨叶提取物得率(%) = 提取所得沉降物重量 / 枸骨叶干粉重量 × 100 %

1.3.1 单因素试验

影响提出的主要因素有:乙醇浓度、固液比、提取时间,分别对以上三因素进行提取工艺的单因素试验。

1.3.2 正交设计试验

根据单因素试验结果,选择影响枸骨叶提取物提取效果因素中有意义的水平进行正交设计试验,经统计分析确定其最佳提取工艺条件。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1乙醇浓度的影响

乙醇的质量分数不同具有所不同的极性，提取物的得率不同。在料液比为1:8，提取2次每次1.5 h的条件下，乙醇浓度对枸骨叶提取得率的影响见图1。从图1可知，随着乙醇质量分数的增高，提取物的得率逐渐增大，当乙醇质量分数达到90 %时得率最高。

2.1.2料液比的影响

由图2可见，随着溶剂量的增加，提取效果也增高。当料液比为1:8.5时，提取物得率最高，超过1:8.5时，提取物得率不再提高。

图1 乙醇浓度的影响

图2 固液比的影响

图3 提取时间的影响

2.1.3 提取时间的影响

在提取液中，当植物细胞内外成分含量未达平衡时，其得率随提取时间的延长而增加，细胞内外浓度达到平衡时成分不再溶出。在乙醇浓度为90 %,固液比为1:8.5，提取次数为2次的条件下，提取时间对提取物得率的影响见图3。由图3可知，提取物得率在3 h达到最高，超过3 h其得率不再提高。

2.2 提取工艺的优化

在单因素试验的基础上，对乙醇浓度、固液比和提取时间三因素进行正交试验以确定最佳提取工艺条件。以提取物得率为评价标准采用L9(34)正交表进行正交试验。每次用枸骨叶干粉50 g。因素水平设计见表1，试验结果见表2。

表1　因素水平设计

表2　L9(34)正交试验结果

由表2可知，影响枸骨叶中熊果酸提取效果各因素的主次关系为RA> RC> RB，即乙醇浓度> 提取时间> 固液比。

2.3 熊果酸的分离

将以上所得浸膏用自创无毒无害的“YCXY-1号”除杂剂处理后过滤，不溶物以乙醇溶解，加活性炭脱色0.5 h，过滤并调节溶液pH值为2左右，经凝析分离、纯化精制即得无色针状结晶熊果酸。

3 结论

3.1 本实验在单因素试验的基础上，对乙醇浓度、料液比和提取时间三因素进行正交试验以确定最佳提取工艺条件。结果表明，以乙醇为溶剂提取枸骨叶中熊果酸的效果较好。其最佳提取工艺参数为：乙醇浓度95 %，固液比1:8.5，于80℃加热回流提取2次，第一次2 h，第二次1.5 h，利用最优提取工艺条件进行提取得到的熊果酸得率为9.86 %。

3.2 熊果酸为五环三萜类化合物，生物活性广泛，且毒性小，副作用少，成为国内外关注的热点。熊果酸在植物在植物体内含量佷低，提取分离难度大。本制备工艺仅以乙醇为溶剂，简化了操作程序，保证了产品无有毒有害溶剂残留，提高了安全性。

3.3 本研究采用自创的“YCXY-1号”除杂剂，不仅能有效去除脂类、类脂类及叶绿素等杂质，而且有利于熊果酸的富集和纯化，其纯度达99.8 %以上。具备了规模化生产熊果酸的技术条件。

[1] 江苏新医学院.中药大辞典(下册)[M].上海:上海人民出版社,1977:1521.

[2] 李维林,吴菊兰,任冰如.枸骨中3种化合物的心血管药理作用[J].植物资源与环境学报,2003,12(3): 6-10.

[3] 姚志容,李军,周思祥.枸骨叶中的熊果类成分[J].中国中药杂志,2009,34(8):999-1002.

[4] 吴致,程志红,刘和平.中药枸骨叶脂溶性化学成分的研究[J].中国药学杂志,2005,40(19):1460-1462.

[5] 杨卫华,赵玉丛.中药枸骨叶化学成分和药理作用的研究进展[J].医药世界,2007(3 ):104-106.

STUDY ON EXTRACTION PROCESS OF URSOLIC ACID IN CORNUTA LEAF

*LI Kai-quan1,2，ZENG Xiao-ming3

(1. Key Laboratory of Province for Research on Active Ingredients in Natural Medicines,Yichun, Jiangxi,336000,China; 2. Chemical and Biological Engineering Department of Yichun University, Yichun, Jiangxi, 336000,China3. Education Science and Technology Park of Yichun University, Yichun, Jiangxi, 336000,China )

To study the best extraction process of ursolic acid in leaves of. Based on the single-factor test, experiment was carried out according toL9 (34)orthogonal table by orthogonalexperimental design method, selecting theethanol concentration(A),solid-liquid ratio(B),extraction time(C) asfactors,three levels for eachfactor. The results showed that the factors affecting the extraction were ethanol concentration > extraction time > solid-liquid ratio. The optimum extraction conditions were that heating reflux extraction were done for two times using 8.5 times the amount of φ = 95% ethanol at 80 ℃, 2 h for the first, 1.5 h for the second.

leaves; ursolic acid; extraction process; orthogonal experiment

S567.1+9

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2012.06.005

1674-8085(2012)06-0021-03

2012-06-12；

2012-08-28

国家“863”高技术研究发展计划项目[2002AA2Z3217]

*李开泉(1954-)，男，江西丰城人，教授，硕士生导师，主要从事天然药物化学研究(E-mail: lkq541024@163.com);

曾晓敏(1971-)，男，江西赣州人，助教，主要从事化学分析研究(E-mail: zengxm1971@163.com).