柠檬酸用于虾头、虾壳的脱钙处理

唐义宝，谢 晶*

(上海海洋大学食品学院，上海 201306)

柠檬酸用于虾头、虾壳的脱钙处理

唐义宝，谢 晶*

(上海海洋大学食品学院，上海 201306)

以南美白对虾虾头、虾壳为原料，利用柠檬酸对其脱钙处理制备甲壳素，通过单因素和响应面试验优化提取条件。结果表明：当柠檬酸质量浓度12.00g/L、料液比1:2.00(g/mL)、时间3.88h时，所得甲壳素灰分含量为1.0g/100g，即已经达到食品级甲壳素的要求。利用柠檬酸脱除虾头、虾壳中的钙盐制备甲壳素，不仅获得食品级的甲壳素，而且反应条件温和、污染小，生成的副产物柠檬酸钙可以作为钙强化剂，提高虾头、虾壳的资源利用率。

南美白对虾；柠檬酸；虾的废弃物；脱钙

我国是虾的养殖大国，2009年的对虾出口量已达130.3万t[1]。而且我国每年都会有大量的南美白对虾以冷冻虾仁方式出口，在加工虾仁的同时也产生了大量的副产物如虾壳和虾头。这些副产物含有丰富的蛋白质、甲壳素和壳聚糖、虾青素、不饱和脂肪酸以及必需氨基酸。南美白对虾虾头中蛋白质、灰分、甲壳素、脂肪的湿基含量分别为6.38%、3.62%、3.33%、2.24%；虾壳中分别为5.22%、5.30%、6.67%、1.09%[2]。因此，这些副产物具有广阔的开发和利用前景。

甲壳素是一种有着广泛应用价值的天然生物多糖高分子材料，其重复单元含有乙酰基，具有很好生物相容性、安全性和降解性，在农业、食品、医药、环境治理等行业都有着广泛的应用前景[3-5]。目前从虾壳和虾壳中提取甲壳素的常用方法是酸碱法[6-7]，其主要步骤是浓碱液脱除蛋白质，再通过盐酸脱除虾头和虾壳中的钙质。这种方法消耗大量的酸碱，而且能耗高，对环境污染大。近年来人们尝试使用EDTA[8-9]、蛋白酶[10]、有机酸[11]等代替强碱强酸来从虾头和虾壳中制备甲壳素，并取得了一定的效果。本实验以柠檬酸代替盐酸脱除虾头和虾壳中的钙质，并通过单因素和响应面试验优化柠檬酸脱钙工艺，研究柠檬酸质量浓度、料液比和时间对脱钙产物甲壳素灰分含量的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南美白对虾于上海市购买。测得虾头含水量约为72%，虾头和虾壳约占虾总质量的50%。而虾头和虾壳的质量比约为3:1。

柠檬酸、氢氧化钠(均为分析纯) 宜兴第二化学试剂厂。

数控恒温水浴锅 宁波天恒仪器厂；组织捣碎机江苏金坛市环宇科学仪器厂。

1.2 柠檬酸脱钙处理方法

工艺流程：虾头、虾壳→捣碎→脱蛋白→脱钙→脱色→干燥→粗甲壳素。

操作要点：捣碎：将120g虾头和虾壳(质量比3:1)放入组织捣碎机中高速捣碎5s。脱蛋白[12]：按1:3(g/mL)的比例加入1mol/L NaOH溶液，95℃恒温水浴2h，过滤留下固体虾壳和虾头继续按1:3(g/mL)的比例加入1mol/L NaOH溶液，95℃恒温水浴2h，再将过滤后的固体虾头和虾壳按1:3(g/mL)的比例加入1mol/L NaOH溶液，95℃恒温水浴1h，过滤漂洗固体虾头和虾壳至中性。脱钙：利用柠檬酸浸泡脱蛋白后的虾头和虾壳以脱除其中的钙质，过滤烘干后即得到粗甲壳素。

1.3 灰分的测定

参照GB 5009.4—2010《食品中灰分的测定》[13]。

1.4 实验设计

甲壳素品级的指标主要是外观、含水量、含氮量和灰分含量，其中灰分含量是评价虾头、虾壳钙盐脱除程度的指标。本实验以灰分含量为指标分别研究柠檬酸质量浓度、料液比和反应时间对脱钙效果的影响，再根据述单因素试验结果，采用Box-Behnken响应面试验设计，使用Expert Design 7.0进行回归分析。因素水平与编码见表1。

表1 Box-Behnken设计试验因素水平及编码Table 1 Factors and levels of Box-Behnken response surface methodology

2 结果与分析

2.1 柠檬酸脱钙效果单因素试验

2.1.1 柠檬酸浓度对产物灰分含量影响

在料液比1:2.09、反应时间10h的条件下，分别使用5、7.5、10、12.5、15g/L的柠檬酸对虾头和虾壳脱钙，考查柠檬酸浓度对甲壳素灰分含量的影响。

图1 柠檬酸质量浓度对甲壳素灰分含量的影响Fig.1 Effect of citric acid concentration on the ash content of chitin

由图1可见，当柠檬酸质量浓度小于10g/L，随着柠檬酸质量浓度的增加，产物甲壳素灰分含量急剧下降，当质量浓度达到10g/L以后，甲壳素灰分含量趋于稳定。因此选浓度7.5、10、12.5g/L为响应面分析试验水平。2.1.2 料液比对产物灰分含量影响

在反应时间10h、质量浓度10g/L的条件下，分别使用 1:0.83、1:1.25、1:1.67、1:2.09、1:2.50(g/mL)的料液比考察不同料液比对甲壳素灰分含量的影响。

图2 料液比对产物甲壳素灰分含量的影响Fig.2 Effect of material-liquid ratio on the ash content of chitin

由图2可知，当料液比大于1:1.67时，随着料液比的减小，甲壳素的灰分含量显著下降，而当料液比小于1:1.67以后，甲壳素灰分含量下降速度明显变缓。因此料液比1:1.25、1:1.67、1:2.09为响应面分析试验水平。2.1.3 反应时间对产物灰分含量的影响

图3 反应时间对甲壳素灰分含量的影响Fig.3 Effect of reaction time on the ash content of chitin

在料液比1:2.09，质量浓度10g/L的条件下，分别使用3、5、8、10、13、15h考察反应时间对甲壳素灰分含量的影响。

由图3可知，随着反应时间的延长，甲壳素灰分含量趋势逐渐减少，但减少并不明显。从3h延长到15h，灰分含量只降低了0.67g/100g。因此时间0.5、3、5.5h为响应面分析试验水平。

2.2 响应面试验分析

2.2.1 响应面设计

表2 响应面分析试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface tests

柠檬酸脱钙响应面试验结果见表2。按Design Expert软件中的Box-Behnken模型，甲壳素灰分含量(y)对柠檬酸质量浓度(x1)、料液比(x2)和时间(x3)的回归方程为：

3因素对甲壳素灰分含量影响有极显著的效果，影响次序为料液比(x2)＞质量浓度(x1)＞时间(x3)。

由表3可看出，试验所选模型不同处理差异极显著(P＜0.0001)，说明回归方程描述各因子与响应值之间的关系时，其应变量与全体自变量之间的线性关系是显著的，即试验方法是可靠的。模型的校正决定系数Radj2＝0.9664，说明该模型能解释96.64%的响应值变化，仅有总变异大约4%不能用此模型来解释。

质量浓度的一次项、时间的一次项和二次项、料液比的一次项对甲壳素灰分含量的影响都是显著的(P＜0.05)，质量浓度和料液比的交互作用、时间和料液比的交互作用以及质量浓度和时间的交互作用以对甲壳素灰分含量的影响也是显著的(P＜0.05)。而质量浓度的二次项和料液比的二次项对甲壳素灰分含量的影响不显著(P＞0.05)。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model

图4 各两因素交互作用对甲壳素灰分含量影响的响应面和等高线图Fig.4 Response surface and contour plots for the effects of crossinteraction among factors on the ash content of chitin

2.2.2 双因子效应分析

由图4a可知，时间一定时，甲壳素灰分含量随着柠檬酸质量浓度的增加逐渐降低。而当柠檬酸质量浓度一定时，甲壳素灰分含量却随着时间的变化却存在有两种情况，而且这种变化依赖于柠檬酸的质量浓度。当柠檬酸含量较低时，甲壳素灰分含量会随着时间的增加而逐渐增大并趋于定值。而当柠檬酸含量高于某一值时，甲壳素灰分含量会随着时间逐渐减小并趋于定值。这和柠檬酸钙的物性有关。柠檬酸钙微溶于水，能溶于酸溶液。当柠檬酸质量浓度较低时，溶液中的柠檬酸随着反应的进行而逐渐减少，最终导致溶液pH值增大而使其中的柠檬酸钙沉淀吸附在甲壳素上，从而使产品灰分含量增大。而当柠檬酸质量浓度较高时，溶液一直呈现酸性，从而柠檬酸钙未出现沉淀，因此灰分含量随着时间逐渐减小。而实验中低质量浓度柠檬酸浓度对照组在3、5h使都出大量白色沉淀也验证了这点。由图4b可知，甲壳素灰分含量随料液比增加而逐渐降低。时间对甲壳素灰分含量的影响受到料液比的影响。在低料液比时，灰分含量会随时间的增大而增高，并趋于定值，当料液比高于某一料液比时，灰分含量会随时间增大而减小，并趋于定值。其原理和上相同。由图4c可知，甲壳素灰分含量随着柠檬酸质量浓度和料液比增大而逐渐降低。等高线接近椭圆，说明时间和料液比的交互作用较明显。柠檬酸质量浓度和料液比都影响时间对甲壳素灰分含量的作用。

2.3 工艺条件的确定及验证实验

表4 甲壳素的分级Table 4 The grades of chitin

表4是甲壳素的分级[14]。当甲壳素灰分含量小于等于1.0时，甲壳素已达到食品级的要求。因此为求节省资源和能源，解方程优化灰分含量为1.0的点。通过Design Expert软件计算得出当柠檬酸质量浓度12.00g/L、料液比1:2.00、时间3.88h时，所得甲壳素灰分含量1.0g/100g。对此工艺进行验证实验，进行3次平行实验，所得结果为(0.92±0.11)g/100g，与理论值基本一致。与段元裴等[15]和陈利梅等[11]所得实验结论相近。

3 结 论

本实验利用柠檬酸代替盐酸对虾头和虾壳脱钙，结合单因素试验和Box-Behnken响应面试验研究柠檬酸质量浓度、料液比和反应时间对虾头、虾壳脱钙的影响。结果表明：3因素对虾头、虾壳脱钙影响大小依次为：液料比＞柠檬酸质量浓度＞反应时间。通过Design Expert 7.0模拟计算得到当柠檬酸浓度12.00g/L、料液比1:2.00(g/mL)、反应时间3.88h时，得到灰分含量1.0g/100g的甲壳素，其灰分含量达到了食品级甲壳素的要求。

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Utilization of Citric Acid for the Decalcification of Shrimp Heads or Shells

TANG Yi-bao，XIE Jing*

(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Citric acid was used to extract chitin by decalcifying shrimp heads and shells ofPenaeus vanmamei. The optimal extraction conditions were explored by single factor and response surface tests. The results showed that the ash content in chitin was 1.0 g/100g, which met the requirement of food grade. The optimal extraction process parameters were citric acid concentration of 12.00 g/L, material-liquid ratio of 1:2.00, and extraction time of 3.88 h. The utilization of citric acid for removing calcium salts from shrimp heads or shells could result in food grade of chitin and mild reaction conditions as well less pollution. In addition, the by-product of calcium citrate could be used as the calcium addition agent, thus enhancing the resource availability of shrimp heads or shells.

Penaeus vanmamei；citric acid；shrimp waste；decalcification

Q539

A

1002-6630(2012)10-0006-04

2011-04-28

2010年国家农业成果转化资金项目(2010GB2C000148)；2010年度上海市农业科技成果转化资金项目(103919N1900)；上海市教育委员会重点学科建设项目(J50704)

唐义宝(1988—)，男，硕士研究生，研究方向为食品科学与工程。E-mail：yibadtang@163.com

*通信作者：谢晶(1968—)，女，教授，博士，研究方向为食品冷冻冷藏。E-mail：jxie@shfu.edu.cn