杏鲍菇酶解液膜分离脱苦工艺的研究

熊文飞，陈日春，唐胜春，宋洪波

（1.福州市食品工业研究所，福建福州 350013；2.福建农林大学食品科学学院，福建福州 350002）

杏鲍菇酶解液膜分离脱苦工艺的研究

熊文飞1，2，陈日春1，唐胜春1，宋洪波2

（1.福州市食品工业研究所，福建福州 350013；2.福建农林大学食品科学学院，福建福州 350002）

研究膜分离技术对杏鲍菇酶解液的脱苦工艺。在单因素实验的基础上，采用响应面实验设计优化得到500u纳滤膜分离脱苦的最优条件为压力0.67MPa、pH7.81、温度45.0℃，脱苦后滤液中氨基态氮透过率为82.6%，滤液苦味评分为1.8分；对膜分离脱苦前后酶解液中基本营养组成含量进行对比分析，经膜分离脱苦处理后的杏鲍菇酶解液中氨基酸总量、鸟苷酸和肌苷酸的保留率分别为82.6%、79.9%和75.2%。结果表明，酶解液经膜分离脱苦后，氨基酸和核苷酸的保留率均较高，脱苦效果良好，说明膜分离技术可应用于蛋白质酶解液的脱苦。

杏鲍菇，酶解液，膜分离，脱苦工艺

杏鲍菇（Pleurotus eryngii）又名刺芹侧耳，富含蛋白质、糖类物质和氨基酸，其中必需氨基酸、甜味氨基酸和鲜味氨基酸分别占氨基酸总量的40.06%、19.39%和24.64%[1-2]。鉴于杏鲍菇所含成分具有的药食兼用价值，近年来以杏鲍菇为原料提取其有效成分的研究逐渐成为热点。由于酶法提取具有条件温和，对有效成分营养功能特性损害小等优点，因此为研究的重点，但酶法提取液具有较为明显的苦味，从而影响了酶解产物被进一步深加工和利用。据文献报道[3-8]，蛋白质酶解液之所以产生苦味，其原因是由于蛋白质经水解成多肽和氨基酸后，埋藏在其内部的疏水性氨基酸残基会暴露出来与味蕾接触，从而产生苦味。多肽的苦味程度不仅与其氨基酸的组成、序列和立体结构均有着密切的联系，而且还取决于多肽相对分子量的大小和疏水性的强弱，分子量大于6000u的多肽无苦味，而介于500～1000u的短肽苦味最强。目前蛋白质酶解产物中苦味肽的脱除方法[3-4]主要有选择性分离法、掩埋法和生物酶解法，其中选择性分离法又包括吸附分离、沉淀分离、萃取分离和膜分离。与其他分离方法相比，膜分离具有操作简单、针对性强、分离效率高以及对酶解液中其他无苦味的营养物质影响小等优点，因此本文采用截留分子量为500u纳滤膜将杏鲍菇酶解液中氨基酸、核苷酸等呈味物质与苦味肽分离，为杏鲍菇酶解液的加工和利用扫清障碍以及膜分离技术广泛应用于脱除蛋白质水解产物中的苦味肽提供应用范例和理论基础。

表1 苦味感官评分表Table 1 The table of bitter taste sensory score

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

杏鲍菇 福建农林大学菌菇研究中心提供；纤维素酶（1.5×103U·g-1）、中性蛋白酶（2.0×104U·g-1）和木瓜蛋白酶（6.5×104U·g-1） 南宁庞博生物工程有限公司提供；氢氧化钠、盐酸、甲醛 均为分析纯；甲醇为色谱纯 国药集团化学试剂有限公司提供；鸟苷酸和肌苷酸标准品 中国进出口商品检验检疫技术研究所提供；氨基酸混合标准样 深圳虹彩祥根生物科技有限公司提供。

AR1140电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；ZD-2自动电位滴定仪、自动搅拌器 上海精密科学仪器厂；XMTD-8222自动恒温振荡器 上海精宏实验室设备有限公司；TDL-40B电动离心机上海安亭科学仪器厂；L-8800氨基酸自动分析仪 日立公司；SPD-20A高效液相色谱 日本岛津；YWMIC-03实验室微型多功能膜分离设备 合肥禹王膜工程技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 杏鲍菇酶解液的制备 杏鲍菇干粉→加水匀浆（料液质量比为1∶20）→第一步纤维素酶酶解（温度48.5℃、pH5.50、酶的添加量0.102×103U·g-1、酶解时间210min）→第二步复合酶（中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶=3∶2）酶解（温度57.5℃、pH6.75、酶的添加量4.08×103U·g-1、酶解时间210min）→沸水浴10min灭酶→离心（4000r/min、10min）→酶解液

1.2.2 苦味的评定 采用感官评定的方法[7]，将蛋白酶水解液调至pH为6.50（用浓度为1.00mol/L盐酸或氢氧化钠），并加热至60℃。挑选20名品尝者（男女各l0人，均为不吸烟者），并将咖啡因配成浓度分别为：0%、0.025%、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%，其对应的评分值和苦味程度如表1所示。按此评分标准，20名品尝者品尝酶解液的苦味，并与标准液比较进行评分，取平均值表示苦味程度。

1.2.3 氨基态氮透过率的测定 先用蒸馏水将滤液体积稀释到与膜分离前溶液相同体积，再测定滤液中氨基态氮含量，其测定方法参照GB/T 5009.39-2003中甲醛滴定法。氨基态氮透过率按式（1）计算：

1.2.4 氨基酸组成、肌苷酸和鸟苷酸的测定 氨基酸组成的测定参照潘欣等[9]的测定方法，肌苷酸和鸟苷酸的测定参照王勇等[10]的测定方法。

1.2.5 500u纳滤膜分离脱苦实验设计

1.2.5.1 膜分离脱苦工艺流程

1.2.5.2 膜分离脱苦实验设计 根据膜分离技术的特点以及膜分离设备的性能，以滤液中氨基态氮透过率和苦味评分为主要评价指标，首先通过单因素实验分别考察不同操作压力（0.40、0.50、0.60、0.70、0.80MPa）、酶解液pH（6.00、7.00、8.00、9.00、10.00）和酶解液温度（25.0、30.0、35.0、40.0、45.0℃）对实验指标的影响，继而采用响应面实验设计对压力、pH和温度作进一步的优化，从而获得最佳的500u纳滤膜分离脱苦条件[11]。优化实验因素水平如表2所示。

表2 优化实验因素水平表Table 2 The factors and levels table of optimize experiment

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 压力对氨基态氮透过率和脱苦效果的影响 固定酶解液pH 7.00、温度30.0℃，不同压力对氨基态氮透过率和脱苦效果的影响如图1所示。

图1 压力对氨基态氮透过率和脱苦效果的影响Fig.1 Effectof pressure on the transmittance of amino nitrogen and debittering

图1表明，压力的增加对氨基态氮透过率和苦味评分的影响趋势均呈先升后降趋势，其原因为压力的上升加剧了膜两侧浓度差极化的形成，从而使得膜的通过性降低所致；由图中可以看出，当压力位0.70MPa时，氨基态氮透过率75.1%，苦味评分2.8分，考虑到充分分离出游离氨基酸用于加工杏鲍菇风味调味品，因此初步确定较佳的分离压力范围为0.70MPa左右。

2.1.2 pH对氨基态氮透过率和脱苦效果的影响 固定操作压力0.70MPa、温度30.0℃，不同酶解液pH对氨基态氮透过率和脱苦效果的影响如图2所示。

图2 pH对氨基态氮透过率和脱苦效果的影响Fig.2 Effectof pH on the transmittance ratio of amino nitrogen and debittering

图2表明，随着pH的上升，氨基态氮透过率和苦味评分均呈先上升后下降趋势，其原因是苦味肽为两性物质，当pH在其等电点附近时，苦味肽的溶解度最低而不易脱除，而当pH远离其等电点时，苦味肽的溶解度又上升而易于脱除。由图中可以看出，当pH为8.00时，氨基态氮透过率最高，而苦味评分2.7分，因此初步确定较佳的脱苦pH范围为8.00左右。

2.1.3 温度对氨基态氮透过率和脱苦效果的影响 固定操作压力0.70MPa、酶解液pH8.00，不同酶解液温度对氨基态氮透过率和脱苦效果的影响如图3所示。

图3 温度对氨基态氮透过率和脱苦效果的影响Fig.3 Effect of temperature on the transmittance ratio of amino nitrogen and debittering

图3表明，温度的上升均能明显提高氨基态氮透过率和苦味评分，其原因为温度的上升降低了酶解液的粘度，提高了其分散性所致；由图中可以看出，当温度上升到40.0℃之后，氨基态氮透过率的增加趋势趋于平缓，且苦味评分还弱有上升趋势，结合纳滤膜对温度的承受能力，因此初步确定较佳的脱苦温度范围为40.0℃左右。

2.2 响应面优化实验结果与分析

2.2.1 实验结果的回归与方差分析 响应面优化实验设计方案与结果如表3所示。

表3 实验设计与结果Table 3 Experimental designs and results

采用Design Expert 8.05数据分析软件对表3中的实验结果进行方差分析，结果见表4。

根据表4方差分析结果，剔除p＞0.05的不显著项，得到简化后的回归方程式（2）、式（3）。

比较回归方程式（2）一次项回归系数绝对值的大小可知各因素对氨基态氮透过率影响的主次顺序为：温度＞pH＞压力，一次项、二次项和因素间的交互作用对氨基态氮透过率的影响均显著。比较回归方程式（3）一次项回归系数绝对值的大小可知各因素对苦味评分影响的主次顺序为：压力＞pH＞温度，一次项、压力和温度二次项对苦味评分的影响显著。回归方程式（2）和式（3）的失拟项均不显著，可用来预测膜分离条件的变化对氨基态氮透过率和滤液苦味评分的影响。

表4 方差分析结果Table 4 The results of variance analysis

2.2.2 因素的效应分析 采用Design Expert 8.05数据分析软件对表3中实验结果进行响应面分析，分析各因素及相互间的交互作用对氨基态氮透过率和苦味评分的影响。

2.2.2.1 各因素对氨基态氮透过率的影响 各因素间的交互作用对氨基态氮透过率的影响如图4～图6所示。

图4 压力和pH对氨基态氮透过率的影响Fig.4 Effect of pressure and pH on the transmittance ratio of amino nitrogen

图4表明，在实验因素水平范围内，压力和pH对氨基态氮透过率的影响相同，均呈先升后降趋势；由图中等高线的疏密度和形状可以看出，压力和pH的交互作用对氨基态氮透过率的影响显著，其中氨基态氮透过率对压力的变化较pH更为敏感。

图5 压力和温度对氨基态氮透过率的影响Fig.5 Effectof pressure and temperature on the transmittance ratio of amino nitrogen

图5表明，当温度一定时，随着压力的增加，氨基态氮透过率先增加到最大值后开始下降；在实验因素水平范围内，当压力一定时，氨基态氮透过率随着温度的上升而增加。由图中等高线的疏密度和形状可以看出，压力和温度的交互影响对氨基态氮透过率的影响显著，其中氨基态氮透过率对压力的变化较温度更为敏感。

图6 pH和温度对氨基态氮透过率的影响Fig.6 Effectof pH and temperature on the transmittance ratio of amino nitrogen

图6表明，当温度一定时，氨基态氮透过率随着pH的上升而呈现先增后降趋势；当pH一定时，在实验因素水平范围内，随着温度的上升，氨基态氮透过率持续增加。由图中等高线的疏密度可以看出，pH和温度的交互作用对氨基态氮透过率的影响很显著。

综合分析，各因素间的交互作用对氨基态氮透过率的影响均很明显；在实验因素水平范围内，温度的上升有利于提高氨基态氮透过率；只有压力和pH处于适当的水平时，才能获得较高的氨基态氮透过率。2.2.2.2 各因素对苦味评分的影响 各因素间的交互作用对氨基态氮透过率的影响如图7～图9所示。

图7 压力和pH对苦味评分的影响Fig.7 Effect of pressure and pH on the bitterness score

图7表明，当pH一定时，随着压力的增加，苦味评分呈现先增后降趋势；当压力一定时，在实验因素水平范围内，苦味评分随着pH的增加而上升。由图中等高线的疏密度可以看出，压力和pH的交互作用对苦味评分的影响不显著。

图8 压力和温度对苦味评分的影响Fig.8 Effectof pressure and temperature on the bitternessscore

图8表明，在实验因素水平范围内，压力和温度对苦味评分的影响相同，均呈先升后降的趋势；由图中等高线的疏密度可以看出，苦味评分对压力和温度的交互作用不敏感。

表5 酶解液中氨基酸与核苷酸含量（g/100mL）Table 5 The contentof amino acids and nucleeotide in the enzymatic hydrolyzate（g/100mL）

图9 pH和温度对苦味评分的影响Fig.9 Effectof pH and temperature on the bitterness score

图9表明，当温度一定时，在实验因素水平范围内，苦味评分随着pH的增加而上升；当pH一定时，在实验因素水平范围内，苦味评分随着温度的增加而上升。由图中等高线的疏密度可以看出，苦味评分对pH和温度的交互作用不敏感。

综合分析，各因素间的交互作用对苦味评分的影响不明显；在实验因素水平范围内，各因素水平值的增加均会提高苦味评分值。

2.2.3 最优脱苦条件的确定和验证 通过Design Expert 8.05数据分析软件对表3实验结果进行综合优化分析，得出最优的500u纳滤膜分离脱苦条件为：压力0.67MPa、pH7.81、温度45.0℃。软件预测的氨基态氮透过率为81.3%、苦味评分2.0分；在该工艺条件下对软件优化结果进行实验验证，测得脱苦后的滤液中氨基态氮透过率为82.6%，对滤液的苦味评分为1.8分，表明酶解液在该最优工艺条件下经纳滤膜处理后，苦味肽基本被脱除。

2.3 脱苦后酶解液中的氨基酸与核苷酸含量

在上述最优脱苦条件下所得酶解液中氨基酸和核苷酸的含量如表5所示。

由表5可知，与膜分离前相比，经膜分离脱苦处理后的杏鲍菇酶解液中游离氨基酸总量、鸟苷酸和肌苷酸的保留率分别为82.6%、79.9%和75.2%；按照宁正祥[12]对氨基酸呈味特性的分类，在脱苦后的酶解液中，带有鲜味和甜味的氨基酸分别占氨基酸总量的56.4%和50.9%，这表明杏鲍菇酶解液中呈鲜味物质含量非常丰富，是一款功能突出、营养丰富的调味基料。然而脱苦后的酶解液中还含有42.4%带有苦味的氨基酸，这也从一定程度上解释了脱苦后的酶解液苦味评分为1.8分的原因，虽然含有部分苦味氨基酸，但苦味评分的结果表明苦味对口感的影响并不明显。

3 结论

通过单因素实验和响应面实验设计优化，得到500u纳滤膜脱苦的最优条件为压力0.67MPa、pH7.81、温度45.0℃，经脱苦后滤液中氨基态氮透过率为82.6%，滤液苦味评分为1.8分。对膜分离脱苦前后酶解液中基本营养组成含量进行对比分析，经膜分离脱苦处理后的杏鲍菇酶解液中游离氨基酸总量、鸟苷酸和肌苷酸的保留率分别为82.6%、79.9%和75.2%。

[1]王凤芳.杏鲍菇中营养成分的分析测定[J].食品科学，2002，23（4）：132-135.

[2]谷延泽.白灵菇和杏鲍菇的营养分析与比较[J].安徽农业科学，2009，37（21）：9931-9932.

[3]何慧，王进，裴凡，等.蛋白水解物与苦味的构效关系及脱苦研究[J].食品科学，2006，27（10）：571-574．

[4]Cho M J.Characterization of bitter peptides from soy protein hydrolysates[D].Columbia：University ofMissouri-Columbia，2000．

[5]Fitz Gerald R J，Cuinn G O.Enzymatic debittering of food protein hydrolysates[J].Biotechnology Advances，2006，24：234-237．

[6]Ney K H.Prediction of bitterness of peptides from their amino acid composition[J].Z Lebensm-Unter Forsch，1971，147：64-68．

[7]邓勇，冯学武.大豆多肽分子质量分布与苦味的确定[J].中国农业大学学报，2001，6（4）：98-102．

[8]马铁铮，王强，周素梅.蛋白短肽苦味成因与脱苦技术研究进展[J].中国粮油学报，2008，23（6）：220-226．

[9]潘欣，邹立和，岳爱玲，等.裂褶菌培养，鉴定及氨基酸组成分析[J].生物技术，2011，21（1）：54-57.

[10]王勇，朱莉萍，闫秋成.高效液相色谱法测定鸡精中呈味核苷酸含量[J].发酵科技通讯，2010，39（4）：16-17.

[11]张立宇.甜性乳清的膜技术处理及双歧杆菌发酵剂的研制[D].呼和浩特：内蒙古师范大学，2009．

[12]宁正祥.食品成分分析手册[M].北京：中国轻工业出版社，1996：14-53．

Study on membrane separation debittering process of the Pleurotus eryngii enzymolysis liquid

XIONGW en-fei1，2，CHEN Ri-chun1，TANG Sheng-chun1，SONG Hong-bo2
（1.Fuzhou Institute of Food Industry，Fuzhou 350013，China；
2.College of Food Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China）

Study on debittering p rocess of memb rane separation technology on Pleurotus eryngii hyd rolysates. On the basis of the sing le-fac tor test，using response surface op tim ization，get the op timal cond itions of the 500u nanofiltration memb rane separation debittering:p ressure 0.67MPa，pH7.81，temperature 45.0℃.In the debittering filtrate，transm ittance of the am ino nitrogen was 82.6%and the bitter score was 1.8.Analysis of the basic nutrition content in the enzymatic solution and debittering filtrate were investigated，in the latter the am ino acids，guanosine monophosphate and inosine monophosphate retention rates were 82.6%，79.9%and 75.2%，respectively.The results showed that in the enzymatic solution，am ino acids and nuc leotide retention were higher，the effect of was debittering was good and the membrane separation technology could be app lied to the p rotein enzyme solution to take off the bitter.

Pleurotus eryngii，enzymolysis liquid，memb rane separation，debittering p rocess

TS201.1

B

1002-0306（2012）22-0287-05

2012－03－30

熊文飞（1985-），男，硕士研究生，研究方向：食品加工理论与应用。