富锗木耳菌丝体主要化学成分分析

朱蕴兰

（徐州工程学院，江苏徐州 221111）

富锗木耳菌丝体主要化学成分分析

朱蕴兰

（徐州工程学院，江苏徐州 221111）

以木耳为研究材料，采用深层液体培养的方法获得富锗木耳菌丝体。测定了富锗木耳菌丝体的主要化学成分含量。结果表明，木耳液体深层培养在锗浓度400μg/mL时，菌丝体生物量、胞内多糖、蛋白质、鸟苷、胞苷含量均达到最高，分别为10.11、106.80、117.52、10.59、11.65mg/g，分别比空白对照提高了10.86%、16.56%、15.27%、49.58%、29.36%。富锗木耳菌丝体氨基酸含量在锗浓度为600μg/mL时含量最高为82.18mg/g，比空白对照提高了11.58%。菌丝体有机锗含量在锗浓度为800μg/mL时最高，达到8.67mg/g，比空白对照增加了57.8倍。在锗浓度实验范围内木耳菌丝体中有机锗含量则随着锗浓度的升高而增加。木耳菌丝体中胞内多糖、氨基酸、蛋白质、鸟苷、胞苷等含量均随着锗浓度的上升呈现先增后减的趋势，锗在低浓度时对上述生物学指标有促进作用，在高浓度时对其有抑制作用。

木耳，深层液体培养，锗，化学成分

木耳（Auricularia auricula），别名黑木耳、光木耳，属担子菌纲，木耳目，木耳科，是人们主要的食用菌之一，在各国各地都有分布。主要在栎、杨、榕、槐等一百二十多种阔叶树的腐木上，单生或群生[1]。木耳是一种药食兼用的真菌，既有营养，味道又鲜美，而且蛋白质、维生素、钙、粗纤维、铁等物质的含量都十分丰富，此外还含有多种微量元素和对人体有益的氨基酸，被称做“素中之荤”。木耳具有益气、润肺、补脑以及促进血液循环等功能，可以抗血栓、抗凝血、软化血管，防止心肌梗塞以及预防和治疗高脂血症、动脉硬化、冠心病，减少心血管疾病的发病率。木耳还可以有助于体内代谢废物的排除，促进胃和肠道的蠕动，化解胆结石和肾结石，预防便秘和结肠癌的发生，同时具有防止肥胖和增强机体免疫的能力。木耳对脂质过氧化有抑制作用，可以延缓衰老，并预防和治疗多种老年疾病[2-5]。锗属于稀有元素，在土壤、植物中的含量一般较低，但有机锗具有增加体内含氧量、清除自由基、抗炎、滋补、强身、抗癌、抗突变和增强免疫的作用[6-8]。已有研究证实食用菌菌丝体对锗富集能力较强，可以使无机锗转化为菌丝体中的有机锗，降低毒性，增加有机锗的利用率，提高锗的生物效应，同时能更好地改善食用菌的品质。有关食用菌对锗富集的研究已有一些[9-10]报道，但木耳对锗的富集研究尚未见报道，本研究试图通过木耳的生物转化作用将无机锗转化为有机锗，并研究木耳在不同锗浓度环境下，主要化学成分含量的变化，为进一步开发木耳产品，提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

木耳（Auricularia auricula） 江苏徐州丰县大山河食用菌生产基地提供；斜面培养基 葡萄糖4%、酵母膏1%、蛋白胨1%、琼脂2%、去离子水；液体种子培养基 葡萄糖3%、蛋白胨1%、硫酸镁0.05%、磷酸二氢钾0.2%、氧化锗350μg/m L、去离子水；发酵培养基 葡萄糖2%、酵母膏0.2%、硫酸镁0.1%、磷酸二氢钾0.2%、去离子水；锗标准液 国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院；氧化锗 国药集团化学试剂有限公司。

HYG-Ⅱ型回转式恒温调速摇瓶柜 上海欣蕊自动化有限公司；GPH-9160型隔水式恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；GZX-DH 40X45-BC型电热恒温干燥箱 上海跃进医疗器械厂；HH-4型数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；FA-210N型电子天平 上海精密仪器有限公司；YXQ-SG41-280型手提式压力蒸汽灭菌器 上海医用核子设备厂；82-1型低速离心机 常州国华电器有限公司；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵 郑州长城科工有限公司；XT-9900型智能微波消解仪 中国上海新拓微波溶样测试技术有限公司；XT-9700型冷却机 中国上海新拓微波溶样测试技术有限公司；TAS-990型原子吸收分光光度计、CW-2000型超声-微波协同萃取仪、TU-1810型紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 木耳富锗培养 活化后的菌种→斜面培养 （23℃，5～7d）→摇瓶种子培养（250mL三角瓶装样量100mL，23℃，120r/min，5～7d）→富锗扩大培养（10%的接种量接入不同锗含量的发酵培养基，23℃，120r/min，5～7d）。

1.2.2 木耳菌丝体干粉的制作 将发酵液经减压抽滤得到菌丝体，然后将菌丝体置于50℃干燥箱中干燥至恒重，研磨成粉末，装入小塑料袋，放入干燥器内备用。

1.2.3 生物量的测定 将发酵液抽滤得到菌丝体，经干燥至恒重，称量，即为生物量。

1.2.4 多糖的提取及测定方法 采用水提醇析的方法提取多糖[11]，取0.15g菌丝粉加水50m L于80℃水浴锅中水浴1h，抽滤取滤液；如此重复三次，将三次抽提液合并，浓缩到约20m L，加3倍体积的95%乙醇，于冰箱中静置醇析过夜后取出，4800r/m in离心10m in，沉淀物加水定容到250m L容量瓶中待用[12]。多糖的测定采用苯酚—硫酸法，根据标准回归方程测定样品多糖含量。多糖含量的计算方法：

多糖含量（%）=（测得多糖溶液的多糖含量×稀释倍数×多糖溶液体积/样品重量）×100

1.2.5 有机锗含量的测定 a.菌丝粉用透析袋透析2d，每天换2～3次水，将其中的无机锗透析掉[13]。b.微波消解（微波消解阶段设置：功率为80%，压力为10kPa，时间300s），得到消解液于冷却机中赶酸30m in，定容到10m L容量瓶中，待测[14]。c.锗含量测定用火焰原子吸收分光光度计（波长265.2nm，工作电流5mA，燃气流量2000m L/m in，燃烧高度5.0mm，负高压350V，光谱带宽0.4nm）测定其吸光度，并通过标准回归方程计算该样品中有机锗的含量[15]。d.锗标准曲线绘制于10m L容量瓶内准确取1m L锗标准溶液，加1%硝酸定容。分别取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0m L于1m L容量瓶中，加5μg基体改进剂硝酸镍[16]，用1%硝酸定容，用上述方法测定，并求回归方程。

1.2.6 蛋白质含量测定 采用考马斯亮兰方法测定，以纯牛血清蛋白为对照。标准曲线制作：分别吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6m L蛋白溶液，用0.15mol/L NaCl补充至1.0m L；加入5.0m L考马斯亮蓝试剂，作用5～30m in后于595nm下测吸光度，以1.0m L水按同样操作为空白，以吸光度值为纵坐标，多蛋白质浓度为横坐标[17]，得标准曲线，并求回归方程。样品测定的按照上述操作步骤操作，测出样品的A595nm的吸光度值，然后依据标准回归方程计算出样品中的蛋白质含量。

1.2.7 氨基酸含量测定 a.制备氨基酸标准溶液：精确称取0.1g在105℃干燥箱中干燥至恒重的L-丙氨酸，用纯水溶解并且定容到100m L，即得到1g/L的标准氨基酸溶液。b.茚三酮试剂的制备：于100m L容量瓶中准确称取2g水合茚三酮，用少量95%乙醇溶解并定容至刻度，制得20g/L的茚三酮水溶液。c.绘制L-丙氨酸标准曲线：分别吸取1g/L的氨基酸标准液0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0m L于容量瓶中，再用缓冲溶液定容至50m L，得到浓度为60、70、80、90、100mg/L的氨基酸溶液。然后于5支试管中分别准确吸取上述试液5m L，取5m L纯水于对照试管中，再分别加入1.0m L茚三酮试剂置于各支试管中，加塞并摇匀。将6支试管一起放入沸水浴（92℃）中，25m in后取出，溶液变为蓝紫色，冷却至室温，在569nm下测其吸光度值[18]，并求标准回归方程。d.样品测定：称取干燥粉碎过筛好的木耳菌丝体0.1g，加入50m L蒸馏水，在60℃下超声波（600W，55kHz）提取110s，重复抽提3次，合并抽提液，用纯水定容至100m L，再于试管中取5.0m L提取液，将木耳提取液用纯水稀释至25m L，定容，摇匀。按1.2.5中c.方法进行操作，测其吸光度，根据标准回归方程计算总氨基酸含量[19]。

1.2.8 鸟苷、胞苷的提取 精确称取0.3g木耳菌丝体3份，分别溶于50m L蒸馏水，选用超声波-微波协同萃取仪中微波和超声波协同作用（微波时间110s，功率200W，超声波频率40kHz，功率50W）重复提取3次，提取后离心过滤，稀释定容至250m L[20]。

1.2.9 鸟苷、胞苷的测定 精密称取10mg鸟苷、胞苷标准品，用纯水溶解，稀释定容至100m L，制备成100mg/L标准储备液。利用100mg/L的鸟苷、胞苷母液，分别配制0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/L的鸟苷、胞苷溶液，紫外分光光度计全波段扫描1.0mg/L的鸟苷、胞苷标准品，分别在215、229nm波长处测定鸟苷和胞苷的最大吸收峰。以鸟苷、胞苷质量浓度（mg/L）为横坐标X，吸光度为纵坐标Y，制作鸟苷、胞苷标准曲线，将提取好的样品按上述方法测定其吸光度，根据标准曲线，计算鸟苷和胞苷的质量浓度。鸟苷、胞苷含量计算：

鸟苷、胞苷含量（mg/g）＝鸟苷、胞苷质量浓度×稀释体积/木耳菌丝体质量

2 结果与分析

2.1 锗浓度对木耳菌丝体生物量的影响

在不同锗浓度培养条件下木耳菌丝体的生物量如图1所示。

图1 不同锗浓度下木耳菌丝体的生物量Fig.1 The biomass of Auricularia auricular mycelia in different concentration of Ge

由图1结合方差分析，锗浓度对木耳菌丝体生物量存在极显著影响（p＜0.01），当浓度为400μg/m L时菌丝体生物量最多，达10.11mg/m L，比空白对照提高10.86%。

2.2 锗浓度对木耳菌丝体胞内多糖含量的影响

根据实验得到多糖含量标准回归方程为：y= 0.0179x+0.085，R2=0.9545，根据标准方程计算得到不同锗浓度培养条件下木耳菌丝体胞内多糖含量如图2所示。

图2 不同锗浓度下木耳菌丝体胞内多糖含量Fig.2 The intracellular polysaccharide contentof Auricularia auricular mycelia in different concentration of Ge

由图2结合方差分析，锗浓度对木耳菌丝体胞内多糖含量存在极显著影响（p＜0.01），当锗浓度为400μg/m L时，菌丝体中胞内多糖含量最多，达106.80mg/g，比空白对照提高16.56%。

2.3 锗浓度对木耳菌丝体有机锗含量的影响

由实验得到锗含量标准回归方程为：y=0.065x+ 0.0037，R2=0.9826，根据标准方程计算得到不同锗浓度培养条件下木耳菌丝体中有机锗含量如图3所示。

由图3结合方差分析，锗浓度对木耳菌丝体中有机锗含量存在显著影响（p＜0.05），当锗浓度在800μg/m L时，菌丝体的有机锗含量最多，达到8.67mg/g，比空白对照增加57.8倍。在本实验中，培养基中锗浓度越高，木耳菌丝体中有机锗含量越多。

图3 不同锗浓度下木耳菌丝体中有机锗含量Fig.3 The organic Ge contentof Auricularia auricular mycelia in different concentration of Ge

2.4 锗浓度对木耳菌丝体蛋白质含量的影响

由实验得到木耳菌丝体蛋白质标准回归方程为：y=0.0078x+0.019，R2=0.9932，根据标准方程计算得不同锗浓度培养条件下木耳菌丝体中蛋白质含量如图4所示。

图4 不同锗浓度下木耳菌丝体蛋白质含量Fig.4 The protein contentof Auricularia auricular mycelia in different concentration of Ge

由图4结合方差分析，锗浓度对木耳菌丝体中蛋白质含量存在极显著影响（p＜0.01），当锗浓度为400μg/m L时菌丝体中蛋白质含量最多，达到117.52mg/g，比空白对照提高15.27%。

2.5 锗浓度对木耳菌丝体中氨基酸含量的影响

由实验得氨基酸含量标准回归方程为：y= 0.1522x-0.0318，R2=0.9994，根据标准方程计算得到不同锗浓度培养条件下木耳菌丝体中氨基酸含量如图5所示。

图5 不同锗浓度下木耳菌丝体氨基酸含量Fig.5 The amino acids contentof Auricularia auricular mycelia in different concentration of Ge

由图5结合方差分析，锗浓度对木耳菌丝体中氨基酸含量存在极显著影响（p＜0.01），当锗浓度为600μg/m L时，木耳菌丝体中氨基酸的含量最多，达到82.18mg/g，比空白对照提高了11.58%。

2.6 锗浓度对木耳菌丝体鸟苷含量的影响

由实验得到鸟苷标准回归方程为：y=0.0018x+ 0.0038，R2=0.9878，根据标准回归方程得出不同锗浓度培养条件下木耳菌丝体中鸟苷含量如图6所示。

图6 不同锗浓度下木耳菌丝体鸟苷含量Fig.6 The guanosine content of Auricularia auricular mycelia in different concentration of Ge

由图6结合方差分析，锗浓度对木耳菌丝体中鸟苷含量存在极显著影响（p＜0.01），当锗浓度为400μg/m L时，菌丝体中鸟苷含量最多，达到10.59mg/g，比空白对照提高了49.58%。

2.7 锗浓度对木耳菌丝体胞苷含量的影响

由实验得出胞苷标准曲线为：y=0.0013x+0.0015，R2=0.9826，根据标准曲线计算得出不同锗浓度培养条件下木耳菌丝体中胞苷含量如图7所示。

图7 不同锗浓度下木耳菌丝体胞苷含量Fig.7 The cytidine contentof Auricularia auricular mycelia in different concentration of Ge

由图7结合方差分析，锗浓度对木耳菌丝体中胞苷含量存在显著影响（p＜0.05），当锗浓度为400μg/m L时，菌丝体中胞苷含量最多，达到11.65mg/g，比空白对照提高了29.36%。

3 讨论

本实验结果表明，在锗浓度较低情况下，锗可以促进木耳菌丝体的形成，提高菌丝体生物量，增加木耳菌丝体胞内多糖、蛋白质、氨基酸、鸟苷和胞苷含量；当锗浓度较高时，对木耳菌丝体的形成有一定的抑制作用，使木耳菌丝体生物量、胞内多糖、蛋白质、氨基酸、鸟苷和胞苷含量减少。锗是稀有元素，机体需求量甚微，在较低浓度时可能由于有机锗参与了菌丝体的代谢活动，构成某些酶的组成部分，通过增加菌丝体的含氧量和清除一定的自由基，使菌丝体代谢活动增加，菌丝体的形成能力增强，从而提高了菌丝体生物量。有研究表明[21]，食药用菌中的锗可能是通过与多糖、蛋白质等相结合的形态存在，因此，通过食用菌的生物转化作用，使无机锗转化为有机锗，并增加了菌丝体的蛋白质和多糖等物质的含量。当锗浓度过高时，由于菌丝体对锗的需要量很微少，加之其具有一定的毒性使菌丝体的代谢受阻，菌丝体的形成能力减弱，降低了菌丝体的生物量、胞内多糖、蛋白质、氨基酸、鸟苷和胞苷等成分的含量。

在本实验锗浓度范围内，木耳菌丝体中有机锗含量随着培养基中锗浓度的升高而增加。这可能是由于培养基中锗浓度的增加，使其转化为有机锗的底物含量增加了，提高了转化效率所致。

4 结论

综上所述，在木耳深层液体富锗培养过程中，培养基中锗浓度对木耳菌丝体主要化学成分含量有显著影响，锗浓度在适当范围内可以增加木耳菌丝体生物量，胞内多糖、蛋白质、氨基酸、有机锗、鸟苷、胞苷等几种主要成分含量，当锗浓度过高时对上述主要成分含量的形成有抑制作用。在锗浓度实验范围内木耳菌丝体中有机锗含量随着锗浓度的升高而增加。

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Main chem ical com positions analysis of Auricularia auricula germanium riched

ZHU Yun-lan
（Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou 221111，China）

Auricularia auricular was used as thematerials and gotm ycelia Ge riched by using of submerged liquid cultivation in d ifferent concentration of Ge，through the determ ination ofm ycelia biological ind icators to find the effects of Ge concentration to the main com position of the Auricularia auricula.The result showed that as the Ge concentration was at 400μg/m L in the culuture med ium，m ycelia biomass，the contents of polysaccharide，p rotein，guanosine and cytid ine reached the peak，10.11，106.80，117.52，10.59，11.65mg/g，respectively.As com pared w ith the control b lank，the m ycelia biomass，the contents of polysaccharide，p rotein，guanosine and cytid ine increased by 10.86%，16.56%，15.27%，49.58%，29.36%，respectively.When Ge concentration was 600μg/m L，the contentof am ino acids reached the highest up to 82.18mg/g，when increased 11.58%com pared w ith the control b lank.When organic germanium concentration was 800μg/m L，organic germanium content reached 8.67mg/g，and it was 57.8 times of the correspond ing control.The content of organic germanium increased w ith the rise of the Ge concentration inc reases in the range of this testofGe concentration.The content of intracellular polysaccharide，am ino acid，p rotein，guanosine and cytidine of Auricularia auricular allalong w ith the rise of the Ge concentration on first increased and then decreased tendency.Ge could im p rove the content above the index when Ge concentration was low，and could inhibition the contentas Ge concentration was high.

Auricularia auricula；submerged liquid culture；germanium；chem ical compositions

TS201.3

A

1002-0306（2012）22-0234-05

2012－08－29

朱蕴兰（1968-），女，讲师，研究方向：应用微生物。