氮浓度对异养小球藻生长及蛋白质含量的影响

李兴锐，王文睿，张永奎，张 鹏，谢通慧，梁 斌

(四川大学化工学院制药与生物工程系，四川成都 610065)

氮浓度对异养小球藻生长及蛋白质含量的影响

李兴锐，王文睿，张永奎*，张 鹏，谢通慧，梁 斌

(四川大学化工学院制药与生物工程系，四川成都 610065)

为了提高异养小球藻蛋白质含量低的问题，研究了异养小球藻生长及蛋白质含量和氮浓度的关系，探究了分阶段调控氮浓度对异养小球藻生长及蛋白质含量的影响。结果表明，氮浓度在3～15mmol/L范围内，小球藻生物量及蛋白质含量随氮浓度增加而增加，生物量从0.91g/L提高到了3.02g/L，蛋白质含量从26.1%提高到了37.4%。分阶段培养小球藻，首先在低氮条件下培养至指数期前期，然后转移至高氮浓度下培养，生物量达3.04g/L，且蛋白质含量提高至53.8%，与自养培养条件下蛋白质含量相当。

小球藻，氮浓度，生长，蛋白质，分阶段调控

小球藻是一种单细胞绿藻，蛋白质含量高，色素、维生素和矿物质含量丰富，具有增强免疫、降血脂和抗病原微生物等保健和药理作用，是优良的饲料资源［1］。在发展“绿色饲料”的时代，合理利用小球藻提高饲料质量和动物产品质量，具有较大的意义。近几年，微藻异养培养是微藻生物技术的研究热点，通过异养培养细胞密度大幅度提高，不受光限制，且已实现生物反应器高密度培养［2－3］。然而异养培养虽然细胞密度大幅度提高，但和自养相比，异养培养的小球藻蛋白质含量降低不少。一般自养培养的小球藻蛋白质含量在50%左右［4］，异养培养蛋白质含量仅有约30%。本文根据藻类对营养物质存在奢侈性吸收现象［5］，采用分阶段调控氮浓度的方法提高异养小球藻蛋白质含量。首先，在低氮条件下培养小球藻至指数生长期，然后在高氮含量条件下诱导藻细胞对氮元素的吸收，提高异养蛋白质含量。这种培养方式既可获得较高的小球藻生物量，又可使蛋白质含量大幅提高，在此研究领域尚未发现有研究报道。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小球藻(Chlorella vulgaris) 为前期从云南滇池水样中筛选所得［6］，简写为C.vulgaris;SE培养基 培养成分为:NaNO3250mg，K2HPO4·3H2O 75mg，MgSO4·7H2O 75mg，CaCl2·2H2O 25mg，KH2PO4175mg，NaCl 25mg，土壤提取液40mL，FeCl3·6H2O 5mg，Fe－EDTA 1mL，A5液1mL，蒸馏水958mL。

LS－B35L－I立式压力蒸汽灭菌器 江阴滨江医疗设备有限公司;SW－CJ－1BU洁净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;HZQ－C空气浴振荡器 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;UV－1800紫外/可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;KXU202－2A恒温干燥器 上海科析实验仪器厂;AR2140分析天平 奥豪斯国际贸易有限公司; TDL－5－A台式中速离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基及培养方法

依实验设计，在含有10g/L葡萄糖的无氮SE培养基中加入适量氮源，在120℃下灭菌20min。在超净台上以10%(V/V)接种量将种子液接种于新鲜培养液中。置于转速为150r/min，温度为25℃的摇瓶中暗培养9d。

根据藻类对营养物质存在奢侈性吸收原理，采用不同的培养阶段来提高小球藻蛋白质含量。首先让小球藻在低氮条件下生长至指数期，然后收集藻细胞并转入氮充足的培养基中再培养。

1.2.2 生物量的测定 分光光度法。用分光光度计在波长680nm下测定光密度(OD680)以示小球藻的生长量。

细胞干重法:取一定体积培养后的藻液，10000r/min离心5min，用蒸馏水洗涤三次，置于恒温干燥箱中60℃烘至恒重。以g干藻体/L藻液表示生物量。

1.2.3 蛋白质的测定 将干燥至恒重的藻体研磨成粉，采用凯氏定氮法测定小球藻细胞中的蛋白质含量［7］。

蛋白质产量=蛋白质含量×生物量

2 结果与讨论

2.1 不同氮浓度对小球藻生长及蛋白质含量的影响

含有10g/L葡萄糖的无氮SE培养基中加入硝酸钠，使氮元素浓度分别为3、9、12、15、18、24mmol/L。如图1所示，3～15mmol/L范围内，小球藻的生物量随着培养液中氮浓度的增加有明显的提高，从0.91g/L提高到了3.02g/L;而高氮浓度24mmol/L则略显抑制小球藻的生长。说明氮浓度对小球藻生长有影响。图2是在氮浓度为15mmol/L条件下小球藻在不同时期蛋白质的含量变化图。进入指数期后小球藻的蛋白质含量逐渐增加，指数期末期(培养第7d)小球藻蛋白质含量达到最大。进入稳定期后(培养第9d)小球藻蛋白质含量降低到30.3%。说明小球藻在指数期大量积累蛋白质。如图3所示，增加氮浓度，小球藻蛋白质含量有明显增加。氮浓度大于15mmol/L时，蛋白质含量略显下降。15mmol/L时蛋白质含量能达到37.4%，产量达到1.09g/L。说明氮浓度对小球藻蛋白质积累亦有影响。图1～图3表明，蛋白质的积累和细胞生长有关，氮浓度对小球藻生长及蛋白质含量的影响作用基本一致。有学者研究表明小球藻的相对生长速度取决于细胞的蛋白质含量［8］。虽然15mmol/L较3mmol/L时蛋白质含量提高了30.2%，但是仍然明显低于自养小球藻的蛋白质水平。

2.2 分阶段调控氮浓度对小球藻蛋白质含量的影响

图1 不同氮浓度下小球藻的生长曲线Fig.1 Growth curves of Chlorella vulgaris under different nitrogen concentrations

图2 15mmol/L氮浓度下小球藻在不同生长时期的蛋白质含量Fig.2 Protein content of Chlorella vulgaris in different growth phase under nitrogen concentrations of 15mmol/L

图3 不同氮元素浓度对小球藻蛋白质含量的影响Fig.3 Effect of different nitrogen concentrations on protein content of Chlorella vulgaris

由于氮浓度对小球藻生长及蛋白质含量的影响作用基本一致，同时小球藻存在对营养物质的奢侈性吸收，因此可以使小球藻在低氮浓度3mmol/L下生长至指数期前期即在培养过程的第3d，然后在无菌操作条件下离心、收集藻细胞。将新鲜的藻细胞打散后立即转移至高氮浓度的培养基中，各培养基中的氮元素浓度分别为9、12、15、18mmol/L。待小球藻生长至指数期末期时，收集藻体，测定其蛋白质含量。分阶段调控氮浓度对小球藻蛋白质含量影响如表1所示，分阶段调控后各浓度下获得的小球藻蛋白质含量分别为44.2%、47.1%、50.0%、53.8%。此法既可获得较高的生物量(最高生物量为3.04g/L)，又可显著提高小球藻蛋白质含量，且已达到自养小球藻的蛋白质水平。将其转入15mmol/L时，提高率为33.7%(对照组的蛋白质含量为37.4%)，18mmol/L时的提高作用更为显著，提高率为44.6%，此时的蛋白质产量也最高1.62g/L。

目前，在解决异养小球藻蛋白质含量低的问题上，很多学者致力于植物生长调节剂对小球藻的生长及蛋白质含量的影响。刘世名等研究发现植物生长调节剂PP333处理后的小球藻蛋白质含量明显提高［9］。焉翠蔚等研究表明多效唑处理后的海洋微藻叶绿素a和蛋白质含量均有所提高［10］。虽然植物生长调节剂可以提高蛋白质含量，但是具有低毒高效的作用，对小球藻的生长具有抑制作用［11］，而分阶段调控氮浓度即不会抑制小球藻的生长，且可明显提高蛋白质含量。

表1 分阶段调控氮浓度对小球藻生长及蛋白质含量的影响Table 1 Effects of regulating nitrogen concentrations at two stages on the growth and protein content Chlorella vulgaris

3 结论

异养培养的小球藻在指数期末期蛋白质含量最高，到达稳定期后蛋白质含量会降低。氮浓度对小球藻生长及蛋白质含量的影响作用基本一致，一定范围内小球藻生物量及蛋白质含量随氮浓度的增加而增加。分阶段调控氮浓度即可获得高生物量，又可将小球藻蛋白质含量由37.4%提高至53.8%，达到自养小球藻蛋白质含量水平，能有效解决异养蛋白质含量低的问题。

［1］王新德，张海英，王明伟.藻类—一种优良的饲料资源［J］.养殖技术顾问，2009(2):48.

［2］Chen Feng.High cell density culture of microalgae in heterotrophic growth［J］.Trends in Biotechnology，1996，14(6): 421－426.

［3］Ip PF，Chen Feng.Production of astaxanthin by the green microagaChlorellazofingienis in the dark［J］.Process Biochemistry，2005，40(2):733－738.

［4］杨帅，许倩倩，王子敬，等.多效唑对异养小球藻USTB－01生长和蛋白质含量的效应［J］.现代化工，2009，29:160－162.

［5］Suttle CA，Harrison PJ.Rapid ammonium up take by freshwater phytoplankton［J］.Journal of Phycology，1988，24(1): 13－16.

［6］王立柱，温皓程，邹渝，等.产油微藻的分离、筛选及自养培养氮源、碳源的优化［J］.微生物学通报，2010，37(3): 336－341.

［7］GB5009.5－2010食品中蛋白质的测定［S］.中华人民共和卫生部，2010.

［8］Fogg GE.藻类的新陈代谢［M］.北京:科学出版社，1962: 90－96.

［9］刘世名，陈靠山，梁世中，等.PP33用于藻类培养影响异养小球藻的生长及蛋白质含量［J］.生物技术，2003，13(1): 23－25.

［10］焉翠蔚，肖宜华，朱岩松，等.多效唑对两种海洋微藻生长和抗氧化酶活性的影响［J］.中国海洋大学学报，2008，3 (2):291－296.

［11］吕富，林伟峰，石祥根，等.NAA对小球藻生长及叶绿素和蛋白质含量的影响［J］.盐城工学院学报，2006，12(2): 42－45.

Effect of nitrogen concentrations on growth and protein content of heterotrophic microalgae

LI Xing－rui，WANG Wen－rui，ZHANG Yong－kui*，ZHANG Peng，XIE Tong－hui，LIANG Bin
(Department of Pharmaceutical and Biological Engineering，Sichuan University，Chengdu 610065，China)

In order to improve the problem of low protein content of heterotrophic Chlorella vulgaris，the effects of nitrogen concentrations on growth and protein content of Chlorella vulgaris were studied.The regulations of nitrogen concentrations in different phases on the growth and protein content of Chlorella vulgaris were also studied.The results showed that protein content of Chlorella vulgaris was increased from 26.1%to 37.4%with the increase of initial nitrogen concentration from 12 to 15mmol/L.The control strategy was that firstly let Chlorella vulgaris grow under low nitrogen concentration to its exponential phase，and then transfered it to high nitrogen concentration.So we could obtaine both high biomass 3.04g/L and high protein content of 53.8%，which reaches the protein level of Chlorella vulgaris in autotrophic culture.

microalgae;nitrogen concentrations;growth;protein;regulations in phases

TS254.1

A

1002－0306(2012)08－0222－03

2011－04－13 *通讯联系人

李兴锐(1987－)，女，硕士研究生，研究方向:食品微生物。

闵恩泽最高科学技术奖研究基金。