胰岛素防治大鼠一氧化碳中毒迟发性脑病的实验研究

廖秋菊 王 晶 秦 俭

(首都医科大学宣武医院急诊科，北京 100053)

急性一氧化碳(carbon monoxide，CO)中毒患者治疗后意识障碍恢复，经过2～60 d“假愈期”，出现以精神意识障碍、大脑皮质局灶性功能障碍、脑神经损害及周围神经炎为主要表现的神经系统损害称为迟发性脑病(delayed neuropsychologic sequelae，DNS)，其发病率国内为10% ～30%，国外为0.8% ～43.0%［1-3］。本病预后差，而且尚无有效的治疗措施，具有高致残率的特点［4］。胰岛素及胰岛素受体普遍存在于中枢神经系统中［5］，能够减少受损神经细胞凋亡，具有神经保护作用［6］。本研究通过观察胰岛素对急性CO中毒动物行为学和神经细胞凋亡的影响，了解胰岛素对DNS是否具有预防和治疗作用，为临床治疗CO中毒提供新的治疗方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年SD大鼠，SPF(specific pathogen free)级，雄性，体质量290～330 g，由首都医科大学宣武医院动物实验室提供，动物许可证号:SYXK(京)2010-0013。

1.2 仪器设备

Morris水迷宫及分析软件(中国医学科学院药物研究所);WFZ800-3型紫外可见单光束分光光度计(北京瑞利光学仪器厂);电子血糖仪(ACCU-CHEK Active，德国罗氏公司);Image-pro Plus图像分析系统(Version4.0)(美国 Media Cybernetics公司)。

1.3 试剂

一氧化碳气体(99.9%)(北京市气体站);普通胰岛素(南京新百药业有限公司);TUNEL凋亡检测试剂盒(德国罗氏公司);罗氏血糖仪血糖试纸(德国罗氏公司);其余试剂均为国产分析纯，购自北京化学试剂公司。

1.4 急性CO中毒大鼠模型建立

实验大鼠购入后，经适应性饲养和编号后进行5 d水迷宫训练。电脑记录大鼠巡游轨迹、从入水至登上安全岛的时间(逃避潜伏期)等数据。逃避潜伏期超过2 min者记为失败。每天训练2～3次，5 d后以巡游轨迹为直线式或趋向式，逃避时间小于1 min的大鼠为合格;逃避时间大于1 min的大鼠被淘汰。参考王耀宏等［7］、付守芝等［8］方法制备大鼠急性 CO中毒模型。将CO气体按照150 mL/kg快速注入大鼠腹腔，每间隔4 h腹腔注射1次，从第2次开始气体量减半，共注入气体3次。观察大鼠急性CO中毒后意识状态及体征。对照组大鼠注射同等剂量空气。

1.5 胰岛素干预

第3次腹腔注射CO气体4 h后，将存活的大鼠采用抽签法随机分为CO中毒模型组(模型组，15只)，CO中毒模型+胰岛素组(胰岛素组，15只)。胰岛素组腹腔注射1.2 mL胰岛素葡萄糖混合液(2 U/Kg普通胰岛素、2 g/kg葡萄糖)，模型组、对照组(8只)腹腔注射等剂量的0.9%氯化钠注射液，连续给药7 d。

1.6 碳氧血红蛋白浓度测定

分别于大鼠中毒后0.5、4及4.5 h测定碳氧血红蛋白浓度。具体方法:大鼠断尾取血，采用改良双波长COHb定量法检测各组大鼠血COHb浓度;取大鼠尾血0.1 mL加0.4 mol/L氢氧化铵 20 mL，混匀，加20 mg低亚硫酸钠混匀;10 min内于535 nm及578 nm波长下测定其吸光度，按照下列公式计算COHb含量(%):

COHb(%)=(2 144×A535/A578－2 168)×100%

1.7 血糖测定

胰岛素组腹腔注射胰岛素前及注射后1 h取鼠尾血用罗氏血糖仪测血糖，对照组和模型组在上述2个时间同时测血糖。

1.8 Morris水迷宫检测

各组大鼠中毒后1～5周重复进行水迷宫检测，每周测试1次。每次将大鼠放入安全岛对侧的象限，记录其逃避潜伏期。

1.9 动物灌注及固定

各组大鼠第5周处死。大鼠腹腔注射10% 的水合氯醛(4 mL/kg)。动物麻醉成功后，将其仰卧于平台上，伸展固定四肢，开胸腹充分暴露心脏和肝脏。剪开左侧心尖部，经左心室-升主动脉迅速插管，同时剪开右心耳，先快速灌注0.9%氯化钠注射液200～250 mL，待肝脏完全变白、右心耳流出澄清液体后，改灌4℃预冷的4%多聚甲醛固定液250～300 mL，其中前1/3量快速灌注，后2/3量缓慢灌注，灌注时间约30 min。当肝脏变硬、四肢僵硬即固定完成。断头取脑，投入含30%蔗糖的多聚甲醛后固定液中，24 h置换新后固定液，4℃保存。

1.10 细胞凋亡检测

取大鼠大脑组织石蜡切片，常规脱蜡后，3%H2O2甲醇室温孵育30 min;用样品通透液冰浴下通透5 min，血清37℃孵育30 min，加入按1∶9稀释好的反应液，37℃孵育30 min;加POD转换液，每步之间用PBST洗涤。DAB工作液显色2 min左右，镜下控制染色程度;中性树胶封片。

阳性细胞计数及光吸收值测量:每组动物各取位置相同的3张脑片，在10倍物镜下，以Image-proPlus 6.0图像分析系统计数海马CA1区及皮质阳性细胞数(TUNEL阳性细胞为棕色深染的细胞)，每张脑片计数10次，取平均值，病理结果评价采用双盲分析。

1.11 统计学方法

所有数据采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，数据用均数±标准差(±s)表示，对水迷宫测试结果进行重复测量数据的多因素方差分析，对免疫组织化学染色结果进行单因素方差分析，组间比较采用多因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠CO中毒后行为表现

大鼠腹腔注射CO气体后5～10 min出现多动、烦躁;染毒20 min后陆续出现少动、四肢瘫软、抽搐、昏迷，黏膜及肢端皮肤呈樱桃红色，部分发生角弓反张。约50%大鼠在中毒24 h内死亡。中毒后8 h左右大鼠恢复正常。大鼠中毒后符合急性CO中毒表现。

2.2 Morris水迷宫检测认知功能

对各组大鼠进行1～5周的水迷宫检测后发现:中毒后第1周模型组及胰岛素组大鼠逃避潜伏期较对照组明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)，巡游轨迹以圆周式和随机式为主;从第2周开始，胰岛素组大鼠逃避潜伏期时间逐渐缩短，至3周已接近对照组，巡游轨迹以直线、趋向势为主，且差异无统计学意义(P＞0.05);从第2周开始，胰岛素组逃避潜伏期比模型组明显缩短，差异有统计学意义(P＜0.05)(图1)。

2.3 细胞凋亡检测结果

图1 不同时间大鼠水迷宫潜伏期时间结果Fig.1 Water maze in rats at different times of incubation time CO group:carbon monoxide group.

利用免疫组化方法测定CO中毒后第5周海马CA1区及皮质神经元凋亡情况。利用400倍显微镜放大观察，发现对照组海马CA1区及皮质区域有少量棕色阳性细胞;模型组及胰岛素组在海马CA1区及皮质均见棕色阳性细胞，胰岛素组阳性细胞数低于模型组，各组间比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。模型组及胰岛素组均高于对照组(P＜0.05)，差异有统计学意义，详见图2。

图2 TUNEL染色检测的脑组织细胞凋亡Fig.2 TUNEL staining of brain cells(400×)CO group:carbon monoxide group.

2.4 各组大鼠不同时间点血COHb

模型组、胰岛素组大鼠中毒后0.5 h血COHb浓度明显升高，波动于48% ～67%之间，与正常组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。达到中、重度中毒标准。中毒后4 h，大鼠COHb浓度下降约25%;再次染毒后0.5 h血中COHb浓度再次达到高水平，3次染毒使得大鼠血COHb浓度达到45%以上并能保持12 h。模型组与胰岛素组比较差异无统计学意义(P ＞0.05)，详见表1。

2.5 腹腔注射胰岛素对大鼠血糖的影响

给药前、后1 h模型组及胰岛素组大鼠静脉血糖水平均较对照组升高(P＜0.05)，差异有统计学意义。与模型组比较，胰岛素组给药前、给药后1h静脉血糖无明显变化(P＞0.05)，详见表2。

表1 不同时间点大鼠血COHb浓度结果Tab.1 Different time points in rat blood COHb concentration results(±s)%

表1 不同时间点大鼠血COHb浓度结果Tab.1 Different time points in rat blood COHb concentration results(±s)%

* P ＜0.05 vs control group;CO:carbon monoxide.

Group Number of case Time/h 0.5 4 4.5 Control group 8 1.00 ±0.17 1.00 ±0.14 1.00 ±0.171 CO group 15 59.67 ±5.16* 44.75 ±3.87* 55.67 ±3.91*RI-treated-group 15 60.04 ±5.44* 45.03 ±4.08* 52.047 ±3.98*

表2 各组大鼠给药前后静脉血糖的比较Tab.2 Rats compared before and after administration of intravenous glucose(±s)mmol/L

表2 各组大鼠给药前后静脉血糖的比较Tab.2 Rats compared before and after administration of intravenous glucose(±s)mmol/L

* P ＜0.05 vs control group;CO:carbon monoxide.

Group Number of case Before administration 1 h after administration Control group 8 5.01 ±0.50 5.02 ±0.49 CO group 15 6.42 ±0.79* 6.24 ±0.71*RI-treated-group 15 6.27 ±0.86* 6.11 ±0.88*

3 讨论

本研究通过对大鼠认知功能以及神经细胞形态学检测发现，胰岛素腹腔注射对DNS模型大鼠中枢神经系统具有保护作用。接受胰岛素干预的大鼠认知功能下降减轻，脑神经细胞凋亡减少，迟发性脑损伤程度显著降低。

CO中毒早期为CO与血液中的血红蛋白结合，形成碳氧血红蛋白(COHb)，导致组织细胞缺氧。脑组织在严重缺氧早期，神经元出现变性坏死;同时脑组织的血管内皮细胞也因缺氧出现变性及功能障碍，导致血管通透性增强造成脑水肿;血管内血流缓慢甚至形成微血栓使脑组织更广泛的缺血。由于脑组织严重缺氧、缺血及CO本身的细胞毒性作用，增强神经元氧化应激反应、Ca2+内流大量增加，兴奋性氨基酸释放增加并启动神经元凋亡信号转导，凋亡相关蛋白表达、合成增加，从而造成神经元凋亡，导致CO中毒后迟发性神经损伤。因此CO中毒机制本身与缺血缺氧致脑损伤机制极为相似。

本实验采用王耀宏等［7］、付守芝等［8］腹腔注射 CO气体法成功制备大鼠DNS模型。此方法与吸入CO气体方法比较具有操作简便，所需CO量明显减少，费用低廉，不需特殊仪器，染毒剂量容易控制，影响因素少等特点。McDonnell T J等［9］研究表明，迟发性脑病的发病与中毒程度、昏迷时间和初次治疗效果等密切相关。本实验方法制备的中毒模型使大鼠血中COHb浓度高于48%并维持12 h之久，达到中重度中毒标准，十分类似临床上重症CO中毒病情经过，因此我们认为腹腔注射CO方法制备重度CO中毒模型成功。

Morris水迷宫实验是判断大鼠学习和记忆能力的重要指标，能敏感的反映出脑认知功能区损害后的认知功能变化［10］。本实验发现，胰岛素组大鼠逃避潜伏期明显低于模型组，说明胰岛素组大鼠学习记忆能力明显提高。胰岛素已被证明在人类与实验动物中都具有记忆增强效应。实验显示，在大鼠脑缺血后立即同时给予胰岛素，可减轻大鼠在缺血1～2个月后的学习能力缺陷，而仅增加葡萄糖的供给则不能产生上述作用［11］。我们的实验结果证明，胰岛素还可以改善CO中毒大鼠的学习、记忆能力。

海马结构(hippocampal formation)是大脑边缘系统的一个重要组成部分，其功能主要参与学习与记忆、情绪反应以及调节内脏活动等［12］。皮质与海马在解剖学上有密切的联系，因此，皮质在认知过程中也扮演了十分重要的角色［13］。海马神经元细胞，尤其是CAl区对缺血缺氧十分敏感［14-15］，海马的损伤会导致学习记忆的障碍［16］。付守芝等［8］采用一次性腹腔注入CO气体(150 mL/kg)制备模型，采用TURNEL法检测脑组织，发现CO中毒后6周迟发性脑病大鼠海马区见较多凋亡细胞表达，明显高于非迟发性脑病大鼠，证实凋亡与迟发性脑病有关。

胰岛素及其受体广泛存在于中枢神经系统中，胰岛素及其受体在嗅球、大脑皮质、小脑皮质和海马结构等区域的神经元内表达水平较高，提示其可能参与了如学习和记忆等高级脑功能活动。胰岛素在缺血缺氧模型中对神经元的保护作用已得到证实。Sanderson T H等［17］通过双侧颈动脉夹闭10 min联合低血压的方法制备大鼠全脑缺血再灌注模型，发现一次性给予高剂量胰岛素(20 U/kg)，利用尼氏染色发现胰岛素组大鼠海马CA1区神经元形态、结构改变较小，神经元缺失减少，利用水迷宫实验发现胰岛素组大鼠学习记忆能力更好，说明胰岛素具有神经保护作用。本实验中，CO中毒后给予大鼠腹腔注射胰岛素后第5周TUNEL法检测发现大鼠皮质、海马CA1区神经元凋亡均明显低于模型组。说明外源性胰岛素能够减少CO中毒后大鼠海马及皮质神经元变性和凋亡，减轻神经元损伤，从而提高大鼠的认知功能。

综上所述，我们认为外源性应用胰岛素可以减轻大鼠CO中毒后迟发型脑病，其作用机制可能是减轻大脑认知功能区细胞凋亡，改善其认知功能。因此，我们认为在临床上应用胰岛素治疗可以减轻CO中毒后脑损伤，为临床防治CO中毒后迟发型脑病提供新的治疗方法。

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