慢性丙型肝炎患者DNT细胞及T细胞亚群的研究

梁 骑 焦艳梅 计云霞 李 田 吴 昊 张国元 唐 中*

(1.川北医学院附属医院检验科，南充 637100;2.首都医科大学附属北京佑安医院感染科，北京 100069)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)慢性感染是全球范围的重要公共卫生问题之一，全世界感染者已超过一亿七千万。由于血制品的广泛应用，器官移植的兴起及不良生活方式的蔓延等因素。我国的慢性HCV感染人数呈显著上升趋势。慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)由于其肝硬化和肝癌的发生率明显高于慢性乙型肝炎，严重危害了人类的身体健康，而备受重视和关注［1］。近年来HCV感染慢性化的机制尤其是宿主的免疫因素成为研究的热点。CD3+CD4－CD8－(double negative T，DNT)细胞是近年来新发现的一群免疫调节性T细胞，在正常人的外周血约占总淋巴细胞的1% ～5%，该DNT细胞表达Fas/FasL、TNF/TNFR，CD3+、CD4－、CD8－、MHC Ⅰ等［2］。DNT细胞在免疫调节、免疫抑制、自身免疫及抗肿瘤方面具有非常重要的作用［2-5］。国内外未见慢性HCV感染者中DNT细胞文献的报道，为了解HCV感染者机体免疫状态、免疫功能情况，探讨细胞免疫在HCV感染者发病过程中的作用，本课题组用流式细胞仪对92例慢性HCV感染者的DNT细胞及T淋巴细胞亚群进行了检测分析，报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究标本来源于2010年6月至2011年6月首都医科大学附属北京佑安医院感染科门诊及住院患者，92例(男47例，女45例)慢性HCV感染患者年龄(28～66)岁，平均年龄(40±13)岁。另选首都医科大学附属北京佑安医院健康体检者93例(男49例，女44例)，年龄(24～62)岁，平均年龄(32±9)岁，两组患者性别、年龄差异无统计学意义(P＞0.05)。病例选择标准参考2004年丙型肝炎防治指南［6］:血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)反复升高，病程超过6个月;血清HCV RNA(RT-PCR法)和(或)抗HCV(ELISA法)阳性;排除其他病毒感染，包括甲型、乙型、戊型肝炎病毒和巨细胞病毒、EB病毒感染;排除自身免疫性肝炎、乙醇性肝病和代谢性肝病;近3个月内未使用抗病毒药物及免疫抑制剂。

1.2 方法

1.2.1 试剂

改良型RPMI-1640培养基(美国HyClone公司)、聚蔗糖-泛影葡胺分层液(淋巴细胞分离液，Ficoll，天津)，流式抗体:CD3-PerCP/CD4-FITC/CD8-PE三标记单克隆抗体购自美国BD公司。

1.2.2 仪器

流式细胞仪为美国BD公司生产的FACSCantotmⅡ型。

1.2.3 方法

取HCV感染者及健康者外周静脉血1 mL，EDTA-K2抗凝。于每支试管中加入10 μL的三标记单克隆抗体 CD3-PerCP/CD4-FITC/CD8-PE，再加入50 μL抗凝静脉血，充分混匀，25℃避光孵育20 min后，加入红细胞溶解液250 μL，充分溶解红细胞20 min后，以1 200 r/min的速度离心5 min，去上清，PBS缓冲液冲洗2次，最后以500 μL的PBS缓冲液悬浮细胞，流式细胞仪检测10 000个淋巴细胞，各细胞亚群分别用百分比和绝对计数表示，百分比以T细胞的百分比表示，绝对计数则以细胞/mm3表示。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据统计分析，计量资料用均数±标准差(±s)表示，采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢性HCV感染者DNT细胞分布

慢性 HCV感染者 DNT细胞比例(8.57% ±6.16%)高于正常对照组(6.78% ±4.50%)，差异有统计学意义(P＜0.05)(图1A)。慢性HCV感染者DNT细胞绝对数(102.82±85.19)/mm3和正常对照组(118.84±84.83)/mm3相比，差异无统计学意义(P ＞0.05)(图1B)。慢性HCV感染者DNT细胞流式散点图见图2A、B，正常健康对照组DNT细胞流式散点图见图2C、D。

图1 慢性HCV感染者和正常对照组DNT细胞分布情况Fig.1 The distribution of DNT cells between chronic HCV infection and normal control group

2.2 T细胞亚群分布

慢性HCV感染者CD3+CD4－CD8+比例高于健康对照组，差异有统计学意义(P＜0.001)，慢性HCV感染者CD3+CD4+CD8－比例、CD4+/CD8+比值均低于健康对照组，差异均有统计学意义(P＜0.001)，详见表1。

图2 CD3+CD4－CD8－(DNT)细胞流式散点图Fig.2 The flow cytometric dot plots of CD3+CD4－CD8－(DNT)cell

表1 慢性HCV感染者和健康对照组T细胞亚群分布Tab.1 The distribution of T lymphocyte subsets between chronic HCV infection and normal control group

3 讨论

最近的研究［2，4］表明，人类的 DNT 细胞具有免疫抑制功能，是一种新的免疫调节T细胞，通过清除同种同源性的CD8+T细胞和产生IL-4和IL-10等途径对机体起抑制性免疫调节作用。从转基因小鼠中纯化出的DNT细胞可直接清除同种同源性的CD8+T细胞，从普通B57BL/6小鼠、fas基因突变的Ipr小鼠和fasl基因突变的gld小鼠中分离出的DNT细胞，可杀伤已被激活的同种同源性的 CD8+T细胞［2，7］;体外的研究［7］亦表明，人类DNT细胞在体外被激活后可产生IL-4和IL-10，对机体起抑制性免疫调节作用。

本文实验结果显示慢性HCV感染者DNT细胞比例明显高于正常对照组，提示DNT细胞的异常表达可能参与了慢性HCV疾病的发生、发展过程，推测其可能通过抑制辅助性T细胞，使机体免疫功能降低，导致病情的加重或病毒持续感染，使HCV感染慢性化。另一原因可能是感染HCV后，CD4+细胞急剧减少，DNT细胞加速增生补偿 CD4+有关，但对慢性HCV感染者DNT细胞确切的作用及机制目前还不明确，有待于进一步研究。

在HCV的病理生理中，宿主的免疫状态是决定病情发展的关键因素之一。机体维持正常的免疫功能状态，有赖于T淋巴细胞及其亚群之间的相互协调或制约，如果这些细胞的功能和数量发生变化，则可视为免疫功能紊乱，这些均与疾病的发生发展有关。本实验结果显示慢性HCV感染者CD3+CD4－CD8+(杀伤性 T细胞)比例高于健康对照组，而 CD3+CD4+CD8－(辅助性 T细胞)比例、CD4+/CD8+比值均低于健康对照组，这和刘毓刚等［9］报道一致。HCV感染后引起T细胞亚群的这种变化，可能是HCV感染慢性化的重要原因之一，迄今为止，HCV的致病机制仍不很清楚，目前不少学者认为细胞免疫可能是HCV发病的主要机制［10-11］。其主要依据是:①丙型肝炎肝组织特征性的病理改变之一为汇管区淋巴细胞聚集或形成滤泡，甚至出现生发中心。② HCV感染的肝细胞周围有许多的淋巴细胞和单核细胞，有的被感染细胞还和淋巴细胞连在一起。③ CHC患者HCV致敏的CD8+T细胞能溶解自身的肝细胞，具有抗原特异性的CD4+T细胞在清除HCV及致病过程中发挥着重要作用。两者比例发生变化后有可能导致两种细胞不能很好地协调作用，从而影响了机体清除HCV的能力，导致HCV感染的持续。

综上所述，CHC患者DNT细胞百分比显著升高及T淋巴细胞亚群比例改变，可能是导致HCV感染慢性化的重要原因之一。

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