牛肺脏中肝素提取工艺优化

杨怀彬，张 丽，韩 玲，*，曹 晖

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州 730070;

2.陕西秦宝牧业发展有限公司，陕西宝鸡 722300)

牛肺脏中肝素提取工艺优化

杨怀彬1，张 丽1，韩 玲1，*，曹 晖2

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州 730070;

2.陕西秦宝牧业发展有限公司，陕西宝鸡 722300)

本研究以牛肺脏为原料，采用盐解－树脂吸附及蛋白质沉淀除去杂质的方法提取和分离肝素。在单因素实验基础上，选取料液比、盐浓度、树脂用量，利用旋转正交组合设计原理和响应面分析法进行工艺优化。结果表明，最佳提取工艺为料液比1∶15(g∶mL)，盐浓度5%，树脂量7%，此条件下肝素得率理论值为362.02mg/kg，验证实验肝素得率为356.65mg/kg。盐解－树脂吸附方法可行可靠，重复性好，提取完全，更适合工厂化生产，且为秦宝雪花牛肺脏中肝素的开发利用提供理论依据。

肝素，响应面，盐解－树脂吸附，提取

中国年产牛肉约700万t，牛肺脏的量约为75万t，牛肺脏中含有非常丰富的肝素，这就为大量生产肝素提供材料来源。肝素(Heparin)，是由β－D－葡糖醛酸(或α－L艾杜糖醛酸)和N－乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的黏多糖，其不但有抗凝血、抗血栓形成的作用，还有抗炎、抗过敏等生物学功能［1－2］。肝素主要是由紧靠血管的肥大细胞产生，并贮存于肥大细胞的颗粒中，一定的刺激下释放［3－4］。肝素最早从肝脏中提取，1916年美国学者Mcleen在研究凝血问题中，成功地从狗的肝脏提取了肝素［5］，1940年正式纳入美国药典用于临床医学，至今已有70余年历史。目前国内外肝素都是从动物脏器中提取得到的天然肝素及其化合物，近半个世纪随着科学技术的发展和深入研究发现动物肺脏和心脏中肝素逐渐被发现。现有肝素的提取方法有盐解－树脂交换法、酶解－树脂交换法、超声波辅助盐解法和盐解酶解结合法。本实验采用盐解－树脂交换法对牛肺脏肝素提取工艺进行研究和探究，实验简单、安全、可靠、经济节约，为工厂化生产和对牛肺脏肝素提取提供理论和技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

牛肺脏 陕西秦宝牧业发展有限公司秦宝雪花牛，屠宰后直接取肺脏装袋标记放入－4℃冷库中冷冻，在冷冻条件下运到实验室，放在－80℃冷冻室，在7天时间内完成实验;肝素标准品 中国药物生物检定所(北京);陶氏AMBERLITETMFPA98CL食品级特种聚合物(树脂) 上海唯高实业有限公司;氢氧化钠、硫酸、硼砂、乙醇(95%) 均为分析纯。

JJ－2B组织捣碎匀浆机 金坛市医疗仪器厂; PH－3C计 上海佑科仪器仪表有限公司;真空干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;756P紫外－可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;洗脱柱Φ30mm×300mm 大连日普利科技仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 肝素的提取工艺流程 原料→提取→吸附→洗涤→洗脱→沉淀→脱水干燥→肝素钠粗品

1.2.2 具体操作要点

1.2.2.1 预处理 将牛肺样品从冷冻室内取出，在自然条件下解冻。解冻完毕取牛肺样品100g，按1∶10 (g∶m L)加入蒸馏水，在组织捣碎机中充分破碎至肉糜状，转移至1000m L烧杯中备用。

1.2.2.2 提取 采用2mol/L NaOH溶液调杯内肉糜pH至8.5，加入样品量的5%的NaCl 60℃下每间隔10m in搅拌30s，连续进行此操作2h，2h后立即升温至100℃，静置10m in沉淀蛋白，以100目筛过滤，收集滤液［6－8］。

1.2.2.3 吸附 滤液冷却至50℃，用2mol/L NaOH调pH至8.5，加入8%树脂(树脂用蒸馏水冲洗至中性)，于恒温磁力搅拌器中50℃下，连续吸附8h，以100目筛过滤，收集树脂备用。

1.2.2.4 洗涤和洗脱 将树脂装入洗脱柱，以蒸馏水反复冲洗至无色，用1.2mol/L的NaCl浸泡洗涤树脂30m in，弃滤液。在树脂洗脱柱中加入5mol/L的NaCl浸泡3h，用烧杯收集浸提液;再用3.5mol/L的NaCl浸泡2h(连续两次)，用同一个烧杯收集液体，滤液烧杯中备用。

1.2.2.5 沉淀蛋白 将滤液用1∶1(V∶V)的HCl调pH至3.5，静置30m in，沉淀酸蛋白，用滤纸过滤;将上次滤液用2mol/L NaOH调pH10，静置3h，沉淀碱蛋白，用滤纸过滤，滤液备用。

1.2.2.6 乙醇沉淀 取滤液用1.5倍体积95%乙醇加入烧杯中，摇匀静置12h，真空抽滤，保留固体，滤液收集进行乙醇回收。

1.2.2.7 粗品干燥 把抽滤得到的固体在真空干燥箱中60℃下真空干燥，用天平称量至两次的称量重量相差在0.02g即达到恒重，得到肝素粗品。

1.2.3 肝素提取工艺优化设计 选取料液比(g∶m L)、盐浓度、树脂用量3个因素进行肝素得率优化实验，采用旋转正交组合优化设计。

1.2.3.1 肝素提取单因素实验 料液比对肝素得率影响实验:设定蒸馏水和样品的料液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35g/m L七个水平，盐浓度为5%，树脂用量为8%，吸附时间为8h条件下实验;盐浓度对肝素得率影响实验:设定盐浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%七个水平，料液比为1∶15g/m L，树脂用量为8%，吸附时间为8h条件下实验;树脂用量对肝素得率影响实验:设定树脂用量分别为1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%七个水平，料液比为1∶15g/m L，盐浓度为5%，吸附时间为8h条件下实验。

1.2.3.2 旋转组合设计优化实验 在单因素实验的基础上，以料液比、盐浓度、树脂量为变化因子，以肝素浓度为响应值，采用响应面旋转组合方式进行对牛肺脏肝素提取工艺进行优化，共设计实验20组，每组做三个平行，利用Design－Expert8.05b软件对实验数据进行分析处理，以获得最佳工艺参数。实验因素分别以X1、X2和X3代表，肝素的得率用Y代表，因素水平及编码值见表1。

表1 实验因素水平编码表Table 1 Test factor levels and coding

1.2.4 肝素浓度测定

1.2.4.1 标准曲线的绘制 使用肝素标准品来制作标准曲线，准确称取肝素标准品，配成482μg/m L肝素水溶液，再按0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1m L的梯度，分别吸取不同体积的肝素水溶液，用蒸馏水定容到1m L，向每份溶液中分别加入3m L含0.025mol/L硼砂的90%(V∶V)的硫酸溶液，充分摇匀，置于90℃水浴中，搅动，10m in后取出，冷至室温，30m in后采用紫外－可见分光光度计测定298nm下样品光密度(另做不加肝素，以水代之的空白实验作对照)，重复3次，绘制出标准曲线。

1.2.4.2 肝素浓度的测定 采用浓硫酸氧化法来检测溶液中肝素的浓度［9］。将肝素粗品用四分法取出定容至25m L容量瓶中，吸取1m L待测液加入玻璃管中，加入3m L含0.025mol/L硼砂的90%(V∶V)硫酸溶液，摇匀，90℃下水浴，搅动，10min后取出，冷至室温，30m in后采用紫外－可见分光光度计测定其298nm下光密度(另做不加肝素，以水代之的空白实验作对照)，重复3次，取平均值。在标准曲线上即可得到提取物中肝素含量。

肝素得率计算公式:

式中:A为样品所测得的吸光度值;M总为所得肝素粗品的总重量，g;m溶为溶解在25m L容量瓶中肝素的重量，g;m样为所取牛肺样品的重量，g;25为定溶于25m L容量瓶中;n为稀释倍数。

1.2.5 验证实验 根据实验所得最佳提取工艺条件进行实验验证。

2 结果与分析

2.1 肝素浓度标准曲线绘制

采用肝素标准品进行浓度测定，根据测定数据做出肝素浓度标准曲线如图1所示。

以肝素浓度为横坐标X，肝素在298nm的吸光度为纵坐标Y，根据测定结果绘制标准工作曲线，线性回归方程为:Y=0.0039X+0.052，R2=0.9996。

2.2 单因素实验结果与分析

2.2.1 料液比对肝素得率的影响 不同料液比条件下提取肝素的得率见图2。由图2可知，当液料比在5～15m L/g范围内时，随着液料比的增加，肝素得率增加，肝素得率呈上升趋势;当液料比在15～35m L/g范围内时，肝素得率没有明显的增加，差异不显著。因原料中肝素的含量有限，随着料液比增大到一定值时，肝素已经全部溶于溶液中，故料液比达到15m L/g时，肝素得率不再升高。

表3 旋转组合设计回归方程各项方差分析表Table 3 Rotary combination design regression equation the anova table

图1 肝素浓度标准曲线Fig.1 Standard curve of heparin concentration

图2 料液比对肝素得率的影响Fig.2 Effect ofmaterial liquid ratio on heparin yield

2.2.2 盐浓度对肝素得率的影响 图3为不同盐浓度条件下提取肝素的得率。由图3可知，盐浓度达到5%时肝素的得率最大，因为盐浓度的大小与肝素活性和溶解度有关，盐浓度过低肝素溶解不完全，提取率低;盐浓度过高肝素会重新析出，故肝素得率随着盐浓度的增大而增大，但达到一定值时会随着盐浓度的增大而减小。

2.2.3 树脂用量对肝素得率的影响 图4是不同树脂用量对肝素得率的影响结果。从图4中可以得到随着树脂用量的增加肝素的得率不断增加，当树脂用量达到7%左右时肝素得率基本保持不变。溶液中肝素的含量一定，当树脂用量较小时，肝素不能全部被吸附，随着树脂用量增加肝素得率增加，当树脂达到能将所有肝素吸附时，随着树脂用量的增加肝素得率基本不变。

图3 盐浓度对肝素得率的影响Fig.3 Effect of salt concentration on heparin yield

图4 树脂用量对肝素得率的影响Fig.4 Effect of resin content on heparin yield

2.3 响应面法优化肝素提取工艺

2.3.1 响应面结果 采用Design－Expert 8.05b对表2的数据进行多因素回归拟合。回归分析结果及各项方差分析见表3。根据回归方程各项方差分析结果表明，该模型回归显著，说明该模型与实际实验拟合较好，可以作为盐解法提取肝素的理论值。各因素回归拟合后，得到的回归拟合方程为:

从表3中可以得到模型项p≤0.01，说明Y与X1、X2、X3的回归方程是极显著的;失拟项对应的p=0.0591≥0.05，说明所得方程与实际拟合中非正常误差所占比例小，表示Y与X1、X2、X3的回归方程的关系较好。

表2 中心复合设计方案及实验点实验数据YTable 2 Central composite design scheme and sites experimental data Y

由图5～图7可以看出两两因子之间均有交互作用，为了进一步确定最优化组合，采用Design－Expert 8.05b软件进行数据处理，得到肝素提取率最大时的条件，经过分析得出:在X1=0.08g/m L，X2=4.89%，X3= 7.10%时，肝素最大得率为366.965mg/kg，根据实际情况确定最佳提取条件为料液比为1∶15，盐浓度为5%，树脂量为7%，此时的理论最大值为362.022mg/kg。

图5 料液比和盐浓度对肝素提取率影响的响应面Fig.5 Material liquid ratio and salt concentration on the yield of heparin influence the response surface

图6 料液比和树脂量对肝素提取率影响的响应面Fig.6 Material liquid ratio and resin content extraction on the influence of heparin yield response surface

图7 盐浓度和树脂量对肝素提取率影响的响应面Fig.7 Salt concentration and resin content on the influence of heparin extraction yield response surface

2.3.2 验证实验结果 按照以上最佳提取条件组合料液比为1∶15，盐浓度为5%，树脂量为7%进行多次实验验证，得到肝素平均得率为356.65mg/kg，验证值与模型理论值相差1.48%。结果与肝素提取率预测值较接近，故确定此工艺条件为秦宝雪花牛肺脏肝素提取的最佳工艺条件。

3 结论

3.1 采用盐解－树脂吸附对牛肺脏肝素的提取，通过单因素实验和旋转正交组合设计以及响应面分析法对提取工艺优化，结论如下:拟合了料液比、盐浓度、树脂用量这3个因素对肝素提取率的回归模型，经验证实验证明该模型合理可靠，能较好地预测牛肺脏中肝素提取率。通过回归方程系数显著性检验，得到因素的主效应关系为:料液比＞树脂用量＞盐浓度。由该模型确定的最优工艺为料液比为1∶15，盐浓度为5%，树脂量为7%。在此条件下，牛肺中肝素提取率为356.65mg/kg。

3.2 目前国内外常采用的提取肝素的方法有很多。刘忠霞［10］等在肝素的制备与质量控制中采用盐解－树脂交换法在猪小肠粘膜中提取的肝素率为133.33mg/kg。江燕［11］等在肝素钠粗品工业化高效生产工艺的探讨中肝素率为308.00mg/kg。本研究采用盐解－树脂吸附法在最佳提取工艺条件下肝素的提取率高达356.65mg/kg，经过重复实验结果稳定，与其他文献相比有明显的增加。对已经采用最佳工艺提取的肉样同样采取最佳提取条件进行再一次提取，多次实验结果表明第二次的肝素平均得率为0.87mg/kg，从而得到第一次的提取已经将肝素提取完全，不需要再进一步提取。实验采用盐解－树脂吸附法对秦宝雪花牛和秦川牛肺脏肝素提取，此方法操作简单，经济节约，重现性好，更适合于工厂化生产。

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Optim ization of heparin extraction process from bovine lung

YANG Huai－bin1，ZHANG Li1，HAN Ling1，*，CAO Hui2
(1.College of Food Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China; 2.Shaanxi Qinbao Animal Husbandry Development Co.，Ltd.，Baoji722300，China)

The bovine lungs as the research material，extrac ted and separated heparin w ith the salt solution－resin adsorp tion and p rotein to remove impurities p recip itation method.Three extraction parameters inc luding material liquid ratio，salt concentration and resin content were op tim ized using rotating orthogonal combination design p rincip le and the response surface m ethod for p rocess op tim ization.The results ind icated that the best extrac tion p rocess were m aterial liquid ratio for 1∶15(g∶m L)，salt concentration at 5%and resin content of 7%.Accord ing to these cond itions，the yield of heparin was 362.02m g/kg，and under the verificative test cond ition the p rac tical values was 356.65mg/kg.Salt solution－resin adsorp tion method was feasib le and reliab le，repeatability，extrac tion com p letely，more suitab le for industrial p roduction and p rovid ing the theory for the development and utilization of lungs heparin of QinBao cattle.

heparin;response surface;salt solution－resin adsorp tion;extract

TS255.1

B

1002－0306(2012)19－0214－05

2012－04－16 *通讯联系人

杨怀彬(1989－)，男，硕士研究生，研究方向:畜产品加工。

国家现代农业(肉牛牦牛)产业技术体系项目资助(CARS－38)。