麝香保心丸对心力衰竭大鼠肾脏血管紧张素Ⅱ受体各亚型表达的影响

刘 飞 李艳芳* 曹芳芳 张玲姬 白雪源 吕 杨

(1.首都医科大学附属北京安贞医院心内科，北京 100029;2.解放军总医院肾科，北京 100039)

心力衰竭时，肾素-血管紧张素-醛固酮系统(reninangiotensin aldosterone system，RAAS)被激活，其对肾脏的调节作用主要通过ATR来实现。ATR各亚型在肾脏均有表达，对调节肾脏血流灌注、水盐平衡和细胞增生等都有着重要作用。中医中药对心力衰竭的治疗有着重要作用。目前，有关中药对心力衰竭时肾脏ATR各亚型表达影响的报道较少，为此，本文对其进行了研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

清洁级近交系雄性Wistar大鼠，10周龄，质量250～280g，中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，首都医科大学附属北京安贞医院清洁级动物房饲养，许可证号:SCXK-(军)2007-004。动物房温度维持在(22±3)℃，相对湿度为(50% ±20%)。80只雄性Wistar大鼠，采用抽签法随机分为正常对照组(A组，10只，0.9%的氯化钠注射液2mL灌胃)、假手术组(B组，10只，0.9%的氯化钠注射液2mL灌胃)，其余60只制作心肌梗死后心力衰竭模型，术后死亡25只，35只大鼠模型制作成功，采用抽签法随机分为模型组(C组，9只，0.9%氯化钠注射液2mL灌胃)、阳性药物对照组(D组，8只，消心痛按1mg/kg溶于2mL 0.9%的氯化钠注射液灌胃，)、麝香保心丸小剂量组(E组，9只，麝香保心丸按22.5 mg/kg溶于2mL 0.9%的氯化钠注射液灌胃)，麝香保心丸大剂量组(F组，9只，麝香保心丸按45 mg/kg溶于2mL 0.9%的氯化钠注射液灌胃)。每组均为2次/日灌胃，持续8周。之后将以上6组大鼠以1%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，行腹正中切口取肾脏，剔除外周结缔组织，取皮质，立即置于－80℃冰箱保存待测。

注:麝香保心丸的给药剂量按动物与人体表面积换算成等效剂量，22.5 mg/kg为小剂量，45 mg/kg为大剂量。

1.2 实验试剂

麝香保心丸(微粒丸22.5mg):上海和黄药业有限公司生产，批号080704。TRIzol购自美国Gibco公司，反转录酶M-MLV、dNTP及PCR试剂购自TaKaRa Biotechnology生物工程大连有限公司，PCR引物由北京赛百盛公司合成。

1.3 心肌梗死后心力衰竭模型制作

大鼠称体质量后以1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔麻醉，备皮，仰卧固定，行气管插管，连接动物呼吸机(潮气量10 mL/kg，呼吸频率80/min，吸呼比1∶1)，监测心电图。常规强力碘消毒，于胸骨左侧第4肋间开一横切口暴露心脏，由左心耳下方2～3mm结扎左冠状动脉前降支。结扎即刻心电监护显示肢体导联R波振幅明显升高，随后Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVL、aVF和V3导联ST段弓背向上抬高＞0.2mV，并呈动态演变过程，1周时复查心电图见病理性Q波为心肌梗死模型制作成功，心肌梗死4周后超声心动图检测显示，左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)≤45%为心力衰竭模型制作成功的标志。假手术组只栓线，不结扎。

1.4 超声心动图检测心功能

检测前以1%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔麻醉大鼠，胸部备皮，仰卧固定。探头置于胸前，探头频率10MHz，图像深度2.5cm。取胸骨旁左心室长轴及短轴切面进行测量，测量参数包括左心室舒张末内径(left ventricle end diastolic dimension，LVEDD)、左心室收缩末内径(left ventricle end systolic dimension，LVESD)和LVEF，每项指标均测量3个心动周期，结果取平均值。

1.5 RT-PCR检测

采用RT-PCR法检测肾皮质AT1R和AT2R的mRNA表达水平。方法:①提取总RNA:用TRIzol总RNA试剂盒提取大鼠肾脏皮质的总RNA，用紫外分光光度计测定总RNA的浓度，计算样品总RNA浓度。②反转录:取模板RNA 5μg，加入 DEPC 处理水补至10μL，置于80℃水浴中变性5 min，迅速冰浴。依次加入5×buffer 5μL，20mmol/L dNTPs 2μL，0.1mol/L DTT 1μL，RNA 酶抑制剂0.5μL，Oligo-dT 0.5μL，M-MLV 1μL，补DEPC处理水至25μL。混匀，置于37℃水浴孵育1.5 h，得25μL cDNA放置于－20℃冰箱中。③聚合酶链反应:取1μL反转录产物为模板，依次加入10×缓冲液、MgCl2、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物，并加去离子水补至25 μL，混匀。选用管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参照。各指标引物序列与反应参数如下:GAPDH引物序列为:上游引物5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'，下游引物 5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'，反应参数为:94℃ 变性 45s，58℃ 退火45s，72℃延伸45s(30个循环)。AT1R引物序列为:上游引物5'-CGTCATCCATGACTGTAAAATTTC-3'，下游引物5'-GGGCATTACATTGCCAGTGTG-3'，反应参数为:94℃变性45s，61℃退火45s，72℃延伸45s(30 个循环)。AT2R引物序列为:上游引物5'-GTGTGGGCCTCCAAACCATTGCTA-3'，下游引物 5'-TTGCTGCCACCAGCAGAAAG-3'，反应参数为:94℃ 变性 45s，53℃ 退火45s，72℃延伸45s(33个循环)。④扩增的AT1R、AT2R片段长度分别为306和445个碱基对。取10μL PCR产物经1.5% 琼脂糖凝胶电泳分离，Alpha imager 2200(NatureGene Corporation，USA)照相。应用光密度分析测定mRNA的水平。用Quantity one软件对图像进行吸光度分析，以目的条带与内参照条带信号强度的比值代表组织中目的受体的表达水平。

1.6 统计学方法

采用SPSS13.0软件进行统计分析，计量数据以均数±标准差(±s)表示。多样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用Newman-Keuls检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠各亚型mRNA表达水平的比较

B组的AT1R、AT2R与A组比较，差异无统计学意义(P＞0.05);与B组比较，C组大鼠AT1R表达明显上调，AT2R表达明显下调，差异均有统计学意义(P＜0.01);与C组比较，D、E、F组大鼠AT1R表达明显下调，AT2R表达明显上调，差异有统计学意义(P＜0.01);与E组比较，F组大鼠AT1R表达下调更显著(P ＜0.05)(图1，表1)。

图1 各组大鼠AT1R和AT2R mRNA表达水平Fig.1 Level of AT1R and AT2R mRNA expression in each group.

表1 各组大鼠AT1R和AT2R mRNA表达的比较Tab.1 Comparison of AT1R and AT2R mRNA expression in each group (±s)

表1 各组大鼠AT1R和AT2R mRNA表达的比较Tab.1 Comparison of AT1R and AT2R mRNA expression in each group (±s)

*P＜0.05;＊＊P＜0.01 vs group B;△P＜0.05;△△P＜0.01 vs group C;▲P＜0.05 vs group E;A:control group;B:shame group;C:model group;D:medicine control group;E:small dose of Shexiangbaoxin pills;F:large dose of sh xiangbaoxin pills;ATR:angiotensin Ⅱ receptor.

Group Number of case AT1R AT2R A 10 0.48±0.05 0.88±0.05 B 10 0.47±0.08 0.85±0.04 C 9 0.55±0.06* 0.64±0.06＊＊D 8 0.47 ±0.04△△ 0.80 ±0.05△△E 90.49±0.04△ 0.76±0.04△△F 9 0.44 ±0.05△△▲ 0.77 ±0.05△△

3 讨论

麝香保心丸由麝香、人参提取物、牛黄、肉桂、苏合香、蟾酥、冰片等七味药物组成。其中，麝香有扩张血管、强心的作用;苏合香、冰片可减慢心率、增加冠状动脉血流;蟾酥、牛黄可增加心肌收缩力;人参提取物具有抗氧化和减慢心率的功效［1］，上述研究结果为麝香保心丸治疗心力衰竭提供了可靠的理论基础。近年来研究［2-3］表明，长期应用麝香保心丸可以降低冠状动脉粥样硬化性心脏病(以下简称冠心病)心绞痛的发生率，改善心肌梗死的预后，促进心功能的恢复。麝香保心丸的组方遵循“君臣佐使”的中医药原则，其中，君药为麝香;臣药含人参提取物和苏合香;佐药含牛黄、肉桂和蟾酥;使药为冰片。此为不同药性的药物搭配使用，增强疗效而减少不良反应。例如，冰片为寒性药物，但加入肉桂等温性药物后，冰片的扩血管作用得到保留且对胃肠道的刺激减少;麝香和冰片搭配，既保留了改善缺血的作用又减少了冰片的使用剂量。

ATR在肾脏中广泛分布，其中以血管平滑肌细胞表达最为显著。AT1R是介导肾脏功能调节的主要亚型，其表达量在肾脏占90%以上，与血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)结合后可使血管收缩、细胞增生纤维化，并促进肾小管对水钠的重吸收。AT2R表达量在肾脏占5% ～10%，其功能与AT1R相拮抗［4-5］，激动后可产生使血管舒张、抑制细胞增生、促进水盐排泄的作用，是肾脏的保护性受体。

心力衰竭的发生发展是一个有众多神经体液因素参与并共同调节的过程，其中RAAS被激活是机体重要的调节机制之一，其对肾脏的调节作用主要通过ATR来实现。本研究中，心力衰竭大鼠肾脏AT1R的表达水平出现上调，AT2R的表达水平出现下调，与Clayton S C等［6］报道的心力衰竭时兔肾脏ATR表达水平改变的结果相一致。国外有研究［7-8］表明，高浓度的AngⅡ通过激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导途径上调AT1R的表达，提示在AT1R与AngⅡ的作用中存在正反馈调节，心力衰竭时肾脏AT1R表达水平上调可能与这种正反馈调节机制有关。Saito M等［9］的研究发现，AT1R被激活后会下调AT2R的表达，表明AT2R的表达调控不仅受到RAAS激活的影响，还可能与AT1R和AT2R之间的交互作用有关。

本研究中，药物治疗8周后，与C组比较，D、E、F组大鼠AT1R表达明显下调，究其原因可能与药物治疗后机体血流动力学异常得到改善、RAAS激活被抑制有关。RAAS被抑制后，血管紧张素Ⅱ受体相关蛋白(ATRAP)表达增加［10］，ATRAP可通过降低MAPK活性、促进AT1R内化起到抑制AT1R的作用［11-12］。与E组比较，F组大鼠 AT1R表达下调更显著，表明大剂量麝香保心丸对RAAS抑制更强，治疗作用更好。作为肾脏的保护性受体，与C组比较，D、E、F组大鼠AT2R表达明显上调，提示在心力衰竭改善后，机体的代偿能力得到恢复，有利于发挥其生理性保护作用。此外，AT2R表达上调还可能与AT1R 被抑制有关［9］。

心力衰竭时RAAS激活，AngⅡ浓度升高导致肾脏ATR各亚型表达改变，表现为AT1R上调和AT2R下调。本研究结果表明，通过麝香保心丸8周灌胃治疗心力衰竭大鼠，调节了肾脏ATR各亚型的表达，使上调的AT1R出现下调，使下调的AT2R出现上调，对心力衰竭时激活的RAAS起到了有益的调节作用，保护了心力衰竭时受损的肾脏功能。本研究中，与小剂量麝香保心丸比较，大剂量麝香保心丸的治疗作用更为显著，可能与大剂量麝香保心丸对血管的扩张作用进一步增强，更有效地改善了血流动力学有关。因此，推荐在心力衰竭的治疗中使用大剂量麝香保心丸以保护肾功能。

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