复合发酵苹果山药果蔬汁优良乳酸菌菌株的筛选

牛 墨，孟祥晨

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030)

复合发酵苹果山药果蔬汁优良乳酸菌菌株的筛选

牛 墨，孟祥晨*

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030)

以苹果山药复合汁为基质，对37株来源于发酵植物制品中的乳酸菌的发酵性能进行初筛和复筛，从中筛选出产酸性能优良的4株菌，分别为：发酵乳杆菌KLDS1.0646、植物乳杆菌KLDS1.0715、瑞士乳杆菌KLDS1.1017和嗜酸乳杆菌LL1。复筛确定发酵乳杆菌KLDS1.0646、瑞士乳杆菌KLDS1.1017和嗜酸乳杆菌LL1为最佳发酵菌种组合，并通过三因子单形重心设计方法确定三种菌种的最佳使用比例为4∶1∶2。

山药，苹果，发酵，乳酸菌

果汁、蔬菜汁是新鲜水果和蔬菜用压榨或其他方法取得的汁液，由于直接榨汁加工的果蔬汁往往因缺少典型果香而影响市场拓展，将乳酸菌应用于果蔬汁进行乳酸发酵，不仅可提供愉快的呈味呈香物质，赋予果蔬汁优雅协调的乳酸发酵风味，而且可产生人体所必需的多种氨基酸、维生素、消化酶等物质，使果汁具有调节人体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高钙、磷、铁的利用率，促进铁和VD的吸收，提高食物消化率和机体免疫能力等功效[1-3]。苹果中富含糖类、酸类、芳香醇类和果胶物质，并富含多种矿物成分，是良好的生理碱性食品[4]。山药原名薯蓣，是珍贵的药、菜两用食物，含有大量的黏蛋白并具有多种益生功能[5]。山药和苹果所含营养成分丰富，对人体有益，且彼此的营养成分又互相补充，因此开发研究苹果山药乳酸发酵饮料既可使营养更加均衡、全面、易吸收，又可避免因品种单一造成味道欠佳，是较佳的果蔬组合。Kyung[6-7]等人在2005年使用植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和德氏乳杆菌发酵甜菜汁，2006年用植物乳杆菌、干酪乳杆菌和德氏乳杆菌发酵甘蓝汁制得具有益生效果的甘蓝乳酸菌饮料。2011年，Ana[8]等人利用干酪乳杆菌发酵苹果汁制得益生菌饮料。王中凤等[9]也提出，植物乳杆菌、发酵乳杆菌均为优良的果蔬汁乳酸发酵菌。但从产酸量、产酸速度、产品口感、香气等综合评价，多菌株混合共发酵最佳。本文主要对适于苹果山药复合果蔬汁发酵的乳酸菌进行了筛选，对筛选出来的优良发酵菌株进行组合，优选最佳菌株组合，并通过三因子单形重心设计法[10]确定最佳菌株间的比例，以期为苹果山药复合果蔬汁乳酸发酵饮料的研制提供优良菌株和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山药 市售（无霉烂变质);苹果 市售国光苹果（成熟，无腐烂);糖化酶 湖南省津市市新型发酵有限责任公司，酶活50000U/g;果胶酶 肇东市日成酶制有限公司，酶活30000U/g;柠檬酸、白砂糖 均为食品级;供试菌株 乳品科学教育部重点实验室工业微生物菌种保藏中心（KLDS-DICC)保存37株乳酸菌;乳杆菌的培养采用MRS培养基[11];扩培种子培养基[12]：复合果蔬汁（苹果汁∶山药汁=1∶1)+0.5%蛋白胨+0.5%牛肉膏。

九阳多功能榨汁机;DELTA-320 pH计 梅特勒-托利多仪器（上海)有限公司;电热恒温培养箱DHP-9272 上海一恒科技有限公司;电热恒温水浴锅 天津泰斯特仪器有限公司;WY032T手持糖度计

成都万辰光学仪器;GYB-6S均质机 上海华东高压均浆机厂;万用电炉 北京市永光明医疗仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 苹果和山药汁制备的工艺流程 山药汁的制备[13]：山药去皮、切片→0.2%柠檬酸水护色（90～95℃，5min)→加入3倍水置于捣碎机粉碎打浆→糊化（90～95℃，30min)→加入糖化酶糖化（55～60℃，3h)→灭酶（85℃，3min)→纱布过滤→均质机均质（20～25MPa，65～75℃)→山药汁

苹果汁的制备[14]：苹果去皮、切片→0.2%柠檬酸水护色（90～95℃，5min)→加入3倍水置于捣碎机粉碎打浆→加入果胶酶（40～50℃，3h)→灭酶（85℃，3min)→纱布过滤→均质机均质（20～25MPa，65～75℃)→苹果汁

复合果蔬汁发酵基质的制备：将均质后的山药汁、苹果汁用Na2CO3调pH到6.5左右，将山药汁和苹果汁按1∶1混匀，于90～95℃灭菌10min后作为发酵基质备用。

1.2.2 菌株的活化及扩培 乳杆菌在MRS培养基中于37℃条件下培养20h左右进行活化，活化2～3代后的菌株以6%的接种量接种于扩培种子培养基中扩培。

1.2.3 单菌株的初筛 将各供试菌株经活化、扩培后，分别以6%接种量接种于添加3%蔗糖的复合果蔬汁发酵基质中，37℃发酵24h，在此期间每隔4h测一次滴定酸度和pH，选择滴定酸度高、pH低的菌株进行复筛。

1.2.4 优良单一菌株的复筛 将初筛获得的菌株经活化、扩培后，分别以6%接种量接种于添加3%蔗糖的复合果蔬汁发酵基质中，在37℃发酵16h，测定其滴定酸度和活菌数，计算产酸速率，选择产酸速率快、活菌数高的菌株再确定最佳菌株组合。

1.2.5 最佳菌株组合的确定 将筛选出来的菌株经活化、扩培后，不同菌株间以相同比例按6%接种量接种于添加3%蔗糖的复合果蔬汁发酵基质中，在37℃发酵14h，在此期间每隔2h测一次滴定酸度和pH。

1.2.6 发酵菌株间最佳比例的确定 采用混料设计中的三因子单形重心设计[11]优化三种发酵菌种的使用比例，使用实验设计软件Design Expert 7.0.0，用y表示实验指标，A、B、C分别表示筛选出的最佳组合的3株菌（发酵乳杆菌KLDS1.0646、瑞士乳杆菌KLDS1.1017、嗜酸乳杆菌LL1)在混合发酵剂中各占的百分比，确定发酵菌株间最佳比例，根据实验设计按菌种间不同比例接种于复合果蔬汁发酵基质中，于37℃条件发酵14h后，分别测定滴定酸度。

1.2.7 分析方法 可溶性固形物：按GB/T 12143- 2008;pH：按GB/T12456- 2008;总糖、还原糖的测定：GB/T 5009.7- 2008;酸度：采用酸碱滴定法[15]。菌落总数：参照GB/T4789.35-2010进行计数。

2 结果与讨论

2.1 鲜榨果蔬汁主要理化指标的测定

根据1.2.7的分析方法测定鲜榨苹果汁、山药汁主要的理化指标，结果见表1。

表1 鲜榨果蔬汁的理化指标Table 1 The physical and chemical indexes of vegetable and fruit juice

2.2 优良发酵菌株的初筛

复合果蔬汁发酵基质经37株乳杆菌分别发酵后，所获得的pH及滴定酸度见表2和表3。

由表2、表3可知，由于苹果山药复合汁中含有一定量的糖类、蛋白质等营养物质，所有菌株随发酵时间延长，发酵液pH均呈下降趋势，酸度相对呈上升趋势，产酸量不断增加。且在发酵12h时发酵液pH大多降至4.2以下，12h之后pH变化幅度较小，基本趋于稳定;在发酵16h之后滴定酸度的变化幅度较小，基本趋于稳定，说明在12～16h之间可能产生了大量的有机酸，所以初步确定发酵时间为16h。

表2 不同菌株发酵苹果山药汁的pH变化Table 2 Changes of pH in apple and yam juice fermentation by different strains

续表

表3 不同菌株发酵苹果山药汁的滴定酸度的变化（°T)Table 3 Changes of the titration acidity in apple and yam juice fermentation by different strains（°T)

续表

表4 初筛获得菌株在复合果蔬汁基质中发酵的产酸速率及活菌数Table 4 The acid production rate and LAB activity of the apple and yam juice fermentation by the initial screening strain

如表3所示，各菌株在发酵过程中，KLDS1.0646、L33、KLDS1.0715、KLDS1.0719、LL1、KLDS1.9207、KLDS1.0732、KLDS1.0738、L4、KLDS1.1017等10个菌株在发酵16h时的产酸量较大，选择这些菌株对其进行复筛。

2.3 优良发酵菌株的复筛

将添加3%蔗糖的复合果蔬汁发酵基质分别接种10株初筛菌株进行发酵，测定其活菌数及滴定酸度，并计算产酸速率，结果见表4。

如表4可知，发酵性能最好的发酵乳杆菌为KLDS1. 0646;发酵性能最好的植物乳杆菌为KLDS1. 0715;发酵性能最好的瑞士乳杆菌为KLDS1. 1017;发酵性能最好的嗜酸乳杆菌为LL1。对复筛获得的株菌进行配对组合，进一步确定发酵菌种。本实验结果表明，适合苹果山药复合汁乳酸发酵的优良菌株分别为发酵乳杆菌KLDS1.0646、植物乳杆菌KLDS1.0715、瑞士乳杆菌KLDS1.1017和嗜酸乳杆菌LL1。菌株选择是乳酸发酵的关键之一，一般按下列条件进行：具有生香性，无异味;产酸量高;对果蔬发酵适应性强。植物乳杆菌、发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌等均为优良的蔬菜乳酸发酵菌[9]。

2.4 最佳菌株组合的确定

菌种在很大程度上决定了产品最终的口感风味和其他特性。因此，使用多菌种混合发酵生产乳酸发酵饮料，具有更广阔的发展前景[16]。王中凤等[9]也提出植物乳杆菌、发酵乳杆菌均为优良的果蔬汁乳酸发酵菌，从产酸量、产酸速度、产品口感、香气等方面综合评价，多菌株混合发酵最好。

对复筛获得的4株发酵菌株分别按下列方式组合：KLDS1.0646+KLDS1.1017+KLDS1. 0715;KLDS1.0646+ KLDS1.1017+LL 1;KLDS1.0646+KLDS1.0715+LL 1;KLDS1.0646+KLDS1.1017+KLDS1.0715+LL1。每种组合分别按6%接种量（各组合中的菌株等比例)接种于添加3%蔗糖的复合果蔬汁发酵基质中37℃发酵16h，每隔2h分别测定滴定酸度及pH，结果见图1。

图1 复合菌株37℃发酵苹果山药汁过程中滴定酸度（—)和pH（ )的变化曲线Fig.1 The change curve of the titration Acidity（—)and pH（ )in apple and yam juice during the processof fermentation on 37℃by compound strains

由图1可知，菌株组合KLDS1.0646+KLDS1.1017+ LL1的产酸速度最快，最终的滴定酸度也比其他三组高。并且该组合的最终产酸量比三株单独发酵菌株的都高，说明三株菌共同发酵时有一定的共生作用。由于利用不同乳酸菌的生理生化特点，如对糖、蛋白质、氧气等的利用能力的不同，混合菌株发酵时可以互为对方提供适宜的生长环境，并达到代谢产物的互补。在乳酸菌发酵过程中，使用混合菌种发酵明显地优于单菌发酵。研究表明，混合菌种要比单菌种发酵要好。并确定KLDS1.0646+KLDS1.1017+LL1为最佳发酵菌株。发酵乳杆菌KLDS1.0646、瑞士乳杆菌KLDS1.1017、嗜酸乳杆菌LL1三株菌共同发酵比任何单一菌株发酵产酸量都高。由于本研究所选择使用的发酵乳杆菌KLDS1.0646可显著改善小鼠的β-Lg过敏症状[17]，所以确定的最佳发酵菌株具有一定的生理功效。

此外，图1还表明，上述组合的发酵菌种在14h时产酸达到最大量，因此下面的实验确定发酵时间为14h。

2.5 复合发酵剂配比的优化

采用三因子单形重心设计方法确定三个发酵菌株间最佳比例，根据单形重心实验方法的设计进行实验并测定结果，计算实验设计中三个因子的单形坐标与滴定酸度之间的关系，结果见表5、表6。

表5 实验设计与结果Table 5 The design and result of experiments

表6 回归模型方差分析Table 6 Analysis of mean square deviation for regression model

根据实验结果计算的滴定酸度的响应方程如下：

y=79.44A+58.94B+66.16C+17.85AB+38.79AC+ 5.99BC+104.43ABC （1)

由方差分析结果（表6)可知，所得模型极显著（p＜0.01)，失拟项p=0.2323＞0.05，失拟不显著，说明该回归模型是显著的。回归方程与实际实验拟合较好，实验误差较小，说明响应方程（1)模型建立成功。

为了检验响应方程的显著性，对表7中实验的估计值和实测值之间进行t检验。经过t检验，证明在置信度α=0.05，估计值和实测值之间无显著差异，即估计值满足实测值，回归方程（1)在置信度α=0.05预测显著。

表7 验证实验设计与结果Table 7 The design and result of verification experiments

根据回归方程（1)可知，KLDS1.0646对滴定酸度的影响最大，而且LL1对滴定酸度的影响比KLDS1.1017大。因为KLDS1.0646和LL1之间交互作用较大，说明它们具有协同的共生作用。对响应方程进行线性规划求解，得y的最大值为83.7921，相应的编码值为A= 0.579，B=0.127，C=0.294。根据编码值，由公式（1)计算可得实际各菌株的比例，即三种发酵菌株的最佳比例为：KLDS1.0646∶KLDS1.1017∶LL1=4∶1∶2。

作为混合菌种，混菌比例对发酵速度有一定的影响，本实验运用三因子单形重心设计法，通过较少的实验全面了解三者之间的比例变化对滴定酸度的影响，并确定三种菌种的最佳使用比例为4∶1∶2。

3 结论

从37株来源于发酵植物制品中的乳酸菌中筛选出4株能较好发酵苹果山药复合汁的菌种，分别为：发酵乳杆菌KLDS1.0646、植物乳杆菌KLDS1.0715、瑞士乳杆菌KLDS1.1017和嗜酸乳杆菌LL1。并确定发酵乳杆菌KLDS1.0646、瑞士乳杆菌KLDS1.1017、嗜酸乳杆菌LL1三株菌共同发酵比任何单一菌株发酵产酸量都高，表现出一定的共生发酵特性。运用三因子单形重心设计法确定三种菌种的最佳使用比例为4∶1∶2，以6%接种量接种于含3%蔗糖的苹果山药复合发酵基质中，于37℃发酵14h后可获得较好的发酵产品，以期为苹果山药复合果蔬汁乳酸发酵饮料的研制提供优良菌株和理论依据。

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Screening of excellent LAB strains suitable for multi fermentation of the mixed apple and yam juice

Niu Mo，Meng Xiang-chen*
（Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

In this experiment，the mixed juice with apple and yam was used as substrate，and the fermentation characteristics of 37 lactic acid bacteria strains isolated from fermented vegetable products were studied.Four strains including Lactobacillus fermentum KLDS1.0646，Lactobacillus plantarum KLDS1.0715，Lactobacillus helveticus KLDS1.1017 and Lactobacillus acidophilus LL1 with excellent ability of acid production were selected. The optimum combination were Lactobacillus fermentum KLDS1.0646，Lactobacillus helveticus KLDS 1.1017 and Lactobacillus acidophilus LL1，and the optimal proportion of strains was KLDS1.0646∶KLDS1.1017∶LL1=4∶1∶2，which was determined by simplex centroid design.

yam;apple;fermentation;lactic acid bacteria

TS255.44

A

1002-0306（2012)14-0242-06

2012－02－13 *通讯联系人

牛墨（1987-)，女，硕士研究生，研究方向：食品科学。