HPLC法测定甘露醇冲洗液中甘露醇含量的不确定度分析

刘 印，黄国英，于海云

(山东齐都药业有限公司，山东临淄255400)

甘露醇注射液［1］为《中国药典》2010年版(二部)所收载，5%规格可用于外科手术用冲洗液。本文根据《测量不确定度评定与表示》(JJF1059－1999)、《化学分析测量不确定度评定》(JJF1135－2005)和《化学分析中部确定度的评估指南》(CNAS －Q.06:2006)的规定，并参考有关文献［2，3］，对甘露醇冲洗液中HPLC法测定甘露醇含量的测量不确定度进行了分析。找出影响不确定度的因素，以提高数据和测量结果的准确性和可靠性，为评价检测提供科学依据。

1 实验内容

1.1 仪器与试药 Anglient 1200高效液相色谱仪，示差折光检测器。BS110S型分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)。对照品:甘露醇(山东齐都药业自制，批号:1107071，含量100.3%)，山梨醇为自制对照品 (纯度＞98%)。甘露醇冲洗液(山东齐都药业有限公司，批号:101004，规格:1 000 mL:50 g)。

1.2 色谱条件与系统适用性 用磺化交联的苯乙烯二乙烯基苯共聚物为填充剂;色谱柱:Sugar－Pak1色谱柱(6.5 mm×300 mm)，柱温为 80℃;水为流动相，流速 0.5 mL·min－1;示差折光检测器，检测器温度为55℃。另取甘露醇与山梨醇各50 mg，置10 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，甘露醇与山梨醇色谱峰之间的分离度应大于2.0。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液的制备 精密称取甘露醇对照品适量，加水制成每1 mL含5 mg的溶液，即得。

1.3.2 供试品溶液的制备 精密量取本品1 mL(约相当于甘露醇50 mg)，加水溶解定容于10 mL容量瓶中，即得。

1.3.3 测定 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

2 不确定度分析与结果

化学分析中测量不确定度评估过程的步骤有:①被测量量的技术规定;②不确定度来源的确定和分析;③不确定度分量的量化;④计算合成标准不确定度;⑤给出扩展不确定度;⑥报告测量结果及不确定度。下面按这6个步骤进行评定和表示本试验的测量不确定度。

2.1 被测量量的技术规定 主要说明被测量量，本法为外标法测定甘露醇冲洗液中甘露醇的含量，假设直线经过原点，建立其数学模型为:

Cs=(Mr×Vs×As)×F/(Vr×Ar×B)×100%

式中，Cs:为样品中甘露醇浓度(合标示量)%;As:样品的峰面积响应值;Mr:对照品的取样量(g);Vs:样品溶液的体积(mL);Ar:对照品的峰面积响应值;Vr:对照品溶液的体积(mL);F:样品非均匀性校正因子系数，值为1;B为标示量(1 000 mL:50 g为定值，不需要考虑不确定度)。

2.2 不确定度来源的确定和分析

2.2.1 质量(M) 由增量法称量给出样品和对照品的质量，称量不确定度主要来源于以下几个方面:①称量的重复性，属于A类不确定度。可以通过多次重复测量读数、计算得出;②天平校准产生的不确定度，属于B类不确定度;③天平称量最大允差引入的不确定度，属于B类不确定度。

2.2.2 体积(V) 移液管与容量瓶中的溶液体积主要不确定度来源有:①重复性，溶液充满移液管及容量瓶至刻度的变化值，属于A类不确定度，可通过多次测量得出;②容量瓶的允差，确定容量瓶内部体积时的不确定度，属于B类不确定度;③温度系数引起的不确定度，属于B类不确定度，由于本文中测定温度为20℃，与校准时温度一致，故此项可忽略。

2.2.3 峰面积响应值(A) 高效液相峰面积响应值主要由峰面积的重复性与仪器环境、进样体积等因素的不确定度共同引起。峰面积重复性引起的不确定度属于A类不确定度，可通过多次测定得出;仪器环境、进样体积等因素引起的不确定度属于B类不确定度，由于对照品与样品峰面积是在相同条件下测得，所以此项可忽略。

2.2.4 样品均匀性 即样品测量的重复性，样品的取样会影响其含量测定结果，其产生的不确定度可以通过重复多份样品的含量测量来求得，属于A类不确定度。

2.2.5 对照品纯度 甘露醇对照品购自中国药品生物制品检定所，由于尚无法得到不确定度参考值，故此项忽略。不确定度分量因果见图1。

图1 不确定度分量因果图

2.3 不确定度分量的量化

2.3.1 As 样品峰面积重复性，通过测定5份样品的峰面积为1 726 477.8、1 733 043.1、1 724 403.8、1 728 184.1、1 729 142.3，计算 S值为3 229.111 2，测定次数为2 次，则 u

2.3.2 Ar 对照品峰面积重复性，通过测定对照品峰面积5次的峰面积为 1 726 598.8、1 727 114.5、1 727 614.2、1 727 838.2，计算 S 值为1 070.890 1，则 u(Ar)=1 070.890

2.3.3 Mr 对照品称量不确定度主要有两个来源:第一，重复性，也称称量变动性，根据检定证书，变动性标准偏差为0.1 mg;第二，天平校准产生的不确定度，按检定证书给出的不确定度U95=0.01 mg，按正态分布换算成标准偏差为0.01/1.96=0.005 1 mg，由于样品称量采取增重法，所以:

2.3.4 Vr10 mL容量瓶的不确定度来源主要有两种:第一，容量瓶体积的不确定度，按检定证书给出的不确定度U95=0.02 mL，按三角分布换算成标准偏差为0.008 2 mL;第二，温度与校准温度的差异，由于本试验温度为20℃，与校准温度相同，所以此项可忽略。所以:u(Vr)=0.008 2 mL。

2.3.5 Vs10 mL容量瓶的不确定度来源主要有两种:第一，容量瓶体积的不确定度，按检定证书给出的不确定度U95=0.02 mL，按三角分布换算成标准偏差为0.008 2 mL;第二，温度与校准温度的差异，由于本试验温度为20℃，与校准温度相同，所以此项可忽略。u(Vs1)=0.008 2 mL。1 mL移液管的不确定来源主要有两种:第一，容量瓶体积的不确定度，按检定证书给出的不确定度U95=0.007 mL，按矩形分布换算成标准偏差为0.004 0 mL;第二，温度与校准温度的差异，由于本试验温度为20℃，与校准温度相同，所以此项可忽略。u(Vs2)=0.004 0 mL。所以:u(Vs)=mL。

2.3.6 F 取本品平行制备9份样品溶液，分别进行测定，计算 S 值为0.434 8，相对不确定度 u'=0.434 8/100.651 4=0.004 3，F 相关不确定度为 u(F)=u'(F)=0.004 3。

2.4 计算合成相对标准不确定度 含量测定的数值及其不确定度见表1。

表1 含量测定的数值及其不确定度

根据含量计算公式计算甘露醇冲洗液中甘露醇的含量为:Cs=(50.34×10×1 728 250.2)×1/(10×1 726 862.9×50)×100%=100.76%。

对于此乘法表达式，与每个分量相关的不确定度合成如下:u'(Cs)=［u'(As)2+u'(Mr)2+u'(Vs)2+u'(Ar)2+u'(Vr)2+u'(F)2］1/2=0.005 09;u(Cs)=100.76% × 0.005 09=0.512 9%。

不确定度的分量大小见图2。

图2 不确定度的分量大小

2.5 给出扩展不确定度 取置信概率为95%包含因子k=2，将相对合成标准不确定度乘以包含因子得到相对扩展不确定度。U(P)=2 ×0.512 9%=1.02%。

2.6 报告测量结果及不确定度 甘露醇冲洗液中甘露醇的含量为:Cs=(100.76±1.02)%，其中“±”后的数是扩展不确定度U=ku(P)，由 u(P)=0.512 9%和k=2确定。k=2是根据置信概率为95%由t分布确定的。

3 讨论

3.1 环境温度和湿度的随机变化会给质量和体积带来的影响，对质量的影响将其不确定性归入称量重复性中;而对于体积，由于对照品溶液和供试品在相同条件下，由此引入的不确定性可忽略不计。溶液样品的不均匀性，在计算公式中加入了均匀性因子，其作用是将样品不均匀性产生的不确定度带入公式，而与计算结果无关，所以设其值为1。对照品甘露醇购自中国药品生物制品检定所，由于尚无法得到不确定度参考值，故此项忽略。

3.2 为分析不确定度的每个来源对总不确定度的贡献，对6个因素进行处理，见图2。通过对图2的分析表明:对照品的称重引入的不确定度较大，为不确定度的主要来源。

3.3 本文提供了一种检测结果测量不确定度计算的方法和思路，可以推广用于同类方法测定成分的含量，分析引入的不确定度分量，找出影响较大的因素并在以后的实验过程中加以注意和改进，以同步提高检验水平和分析质量。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:88.

［2］黄诺嘉，杨文红，黄奕滨.HPLC法测定芦荟胶囊中芦荟苷含量的不确定度评定［J］.中国药师，2009，12(9):1318－1320.

［3］岑志芳，高卫东.HPLC法测定健胃消食片中橙皮苷含量的测量不确定度分析［J］.中国药房，2010，21(19):1786－1788.