炮制方法对木瓜中齐墩果酸和熊果酸含量的影响

王光宁，崔升淼，梁炳健

(广东药学院中药学院，广东 广州510006)

木瓜为蔷薇科植物贴梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai干燥近成熟果实，习称“皱皮木瓜”，具有舒筋、活络、健脾开胃、镇痛消肿、舒肝止痛、祛风除湿的功效，主要化学成分有黄酮类化合物、萜类化合物、有机酸类、鞣质、多糖、果胶等［1］。齐墩果酸和熊果酸是木瓜中主要药效成分之一，具有保肝、抗肿瘤的作用［2］。已有文献对木瓜药材中齐墩果酸和熊果酸的含量研究［3，4］，作者未见文献报道不同炮制方法对木瓜中的齐墩果酸和熊果酸的含量比较分析研究，因此本试验考察木瓜常见五种炮制品中齐墩果酸和熊果酸的含量变化，探讨炮制过程中温度、时间和辅料对化学成分的影响。

1 实验材料

1.1 仪器 Waters 2695型高效液相色谱仪(Waters 2996二极管阵列检测器);超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);十万分之一电子天平BP211D、恒温水浴锅、中药粉碎机、数字显示干燥箱。

1.2 试药

1.2.1 试剂 甲醇(分析纯)，磷酸(分析纯)，三乙胺(分析纯)，甲醇(色谱纯)，屈臣氏蒸馏水、黄酒(四川巨龙食品有限公司)为食品级。

1.2.2 药材及对照品 木瓜药材(购于广州柏盛堂中药有限公司，由广东药学院中药学院中药资源系马鸿雁博士鉴定为蔷薇科植物贴梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai干燥近成熟果实)，齐墩果酸对照品(供含量测定用，批号:110713－200910，中国药品生物制品检定所)，熊果酸对照品(供含量测定用，批号:110713－200910，中国食品药品检定研究院)

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Kromat Universil C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相:甲醇 － 水(0.4% 磷酸，0.15%三乙胺)=87∶13;紫外检测波长为215 nm;柱温:25℃;流速为 0.75 mL·min－1;进样量:20 μL。齐墩果酸和熊果酸的分离度良好。

图1 空白、对照品与样品HPLC图

2.2 对照品溶液的制备

2.2.1 齐墩果酸 取齐墩果酸对照品，精密称定0.049 5 g，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，备用;精密量取齐墩果酸储备液1 mL置5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，浓度为 0.99 mg·mL－1。

2.2.2 熊果酸 取熊果酸对照品，精密称定0.052 0 g，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，备用;精密量取齐墩果酸储备液1 mL置5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，浓度为 1.04 mg·mL－1。

2.3 样品溶液的制备 通过查阅相关文献［5］及各省市炮制规范整理出常用的木瓜饮片有以下五种。

2.3.1 生品 取木瓜饮片，置60℃烘箱中干燥1 h，取出，待凉后置干燥器中保存。取干燥过的饮片，粉碎，取1.0 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流1 h，静置冷却，称定重量用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.2 炒黄品 取干燥木瓜饮片20 g，置炒制容器中，用文火加热，炒至表面微黄，取出放凉，筛去碎屑，再按生品的制备方法制备样品溶液。

2.3.3 炒焦品 取干燥木瓜饮片20 g，置炒制容器中，用文火加热，炒至表面微焦，取出放凉，筛去碎屑，再按生品的制备方法制备样品溶液。

2.3.4 盐炙品 取干燥木瓜饮片20 g，照2010版《中国药典》附录炮制通则［6］，加盐水拌匀(食盐用量2%)，闷透，置炒制容器内，以文火加热，炒至规定的程度时，取出，放入60℃烘箱烘干，取出，再按生品的制备方法制备样品溶液。

2.3.5 酒炙品 取干燥木瓜饮片20 g，照2010版《中国药典》附录炮制通则［6］，加黄酒(10% ～20%)拌匀，闷透，置炒制容器内，以文火加热，炒至规定的程度时，取出，放入60℃烘箱烘干，取出，再按生品的制备方法制备样品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系 精密量取齐墩果酸对照品溶液0.2、0.5、1、2、4、6 mL 置 10 mL 容量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，注入色谱仪。以峰面积(Y)对浓度(X)计算回归方程Y=5×106X－25 774，R2=0.999 5，线性范围 0.019 8 ～0.594 0 mg·mL－1。

精密量取熊果酸对照品溶液 0.2、0.5、1、2、3、6 mL 置 10 mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，注入色谱仪。以峰面积(Y)对浓度(X)计算回归方程为 Y=6×106X－137 67，R2=0.999 8，线性范围0.020 8 ～0.624 0 mg·mL－1。

2.4.2 精密度试验 取同一份样品溶液，连续重复进样6次，记录峰面积。结果齐墩果酸RSD为1.92%，熊果酸RSD为1.45%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验 精密称取同一批样品6份，按2.3项下方法制备样品溶液，并按2.1项下色谱条件测定，记录峰面积，计算齐墩果酸和熊果酸的含量。结果齐墩果酸平均含量为 0.166 0%，RSD为 1.09%，熊果酸平均含量为0.241 1%，RSD为1.51%;表明该方法重复性良好。

2.4.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、14、16、18、20、24 h 测定记录峰面积。结果齐墩果酸RSD为0.99%，熊果酸RSD为0.95%，表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.4.5 加样回收率试验 取已知齐墩果酸和熊果酸含量的样品约0.5 g，精密称定，平行6份，分别精密加入0.91 mg·mL－1齐墩果酸对照品溶液和1.02 mg·mL－1熊果酸对照品溶液各1 mL，甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，注入色谱仪记录峰面积，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验(n=6)

2.5 样品含量测定 取木瓜各炮制品平行3份，分别按2.3项下方法制成样品溶液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，注入色谱仪，按2.1项下色谱条件进行测定，按外标法计算齐墩果酸和熊果酸的含量，结果见表2。

表2 木瓜各炮制品中齐墩果酸和熊果酸的含量(%，n=3)

结果表明:盐炙品中齐墩果酸的含量最高，炒黄品中熊果酸含量和两者总量最高;而炒焦品中两者含量均为最低，均明显低于生品，炒黄品、盐炙品和酒炙品中两者的含量均比生品有不同程度的增加。

3 讨论

3.1 色谱条件的考察

3.1.1 检测波长 齐墩果酸和熊果酸属于同分异构体，结构相似，HPLC分离中常出现两种物质保留时间接近，难以分离，且分子中只有一个双键，属末端吸收，流动相甲醇的吸收在205 nm附近，极易引起干扰;在210 nm波长处齐墩果酸和熊果酸峰前常有杂峰，影响分离;在215 nm波长处，齐墩果酸和熊果酸峰型较对称、分离度较好，因此选用215 nm作为检测波长。

3.1.2 流动相 参考相关文献和2010版《中国药典》中关于HPLC分离齐墩果酸和熊果酸的流动相，再结合试验摸索结果表明，出峰时间随着碱加入有所延迟，峰型变好，分离度也较好，同时发现随着比例的细小改变，出峰时间和峰型也有着显著变化，最后确定甲醇－水(0.4%磷酸，0.15%三乙胺)=87∶13作为流动相，峰型较好，分离度较大。

3.2 含量结果分析 从试验结果分析可看出，炮制的温度和时间是影响齐墩果酸和熊果酸含量变化的主要因素，文火炒黄后两者成分含量较高，随着炒制时间延长、温度升高炒焦品中两者含量明显下降。加热温度和时间是如何影响齐墩果酸和熊果酸含量，在炮制过程中如何控制条件避免成分损失需要进一步的研究和探索。

［1］吴虹，魏伟，吴成义.木瓜化学成分及药理活性的研究［J］.安徽中医学院学报，2004，23(2):62 －64.

［2］王宏贤.木瓜保肝降酶作用的实验研究［J］.世界中西医结合杂志，2007，2(4):213 －214.

［3］陈建真，敖志辉，陈建明，等.不同产地和品种木瓜及其酒制品中齐墩果酸和熊果酸的含量测定研究［J］.中华中医药学刊，2011，29(10):2194 －2196.

［4］吕美红，谢晓梅，查孝柱，等.反相高效液相色谱法测定木瓜药材及饮片中齐墩果酸和熊果酸含量［J］.安徽中医学院学报，2010，29(3):72 －75.

［5］胡居杰，汪电雷.木瓜炮制历史沿革［J］.安徽中医学院学报，2000，19(6):42.

［6］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(一部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:402－403.